Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. De browserversie die u gebruikt heeft beperkte CSS-ondersteuning. Voor de beste ervaring raden wij u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om voortdurende ondersteuning te garanderen, zullen we de site in de tussentijd weergeven zonder stijlen en JavaScript.
Thermofielen zijn micro-organismen die gedijen bij hoge temperaturen. Het bestuderen ervan kan waardevolle informatie opleveren over hoe het leven zich aanpast aan extreme omstandigheden. Het is echter moeilijk om met conventionele optische microscopen omstandigheden van hoge temperatuur te bereiken. Er zijn verschillende zelfgemaakte oplossingen voorgesteld op basis van lokale resistieve elektrische verwarming, maar er is geen eenvoudige commerciële oplossing. In dit artikel introduceren we het concept van laserverwarming op microschaal over het gezichtsveld van de microscoop om hoge temperaturen te bieden voor thermofiele onderzoeken, terwijl de omgeving van de gebruiker mild blijft. Verwarming op microschaal bij gematigde laserintensiteit kan worden bereikt met behulp van een met goud nanodeeltjes gecoat substraat als biocompatibele en efficiënte lichtabsorber. Mogelijke effecten van vloeistofconvectie op microschaal, celretentie en centrifugale thermoforetische beweging worden besproken. De methode is gedemonstreerd bij twee soorten: (i) Geobacillus stearothermophilus, een actieve thermofiele bacterie die zich voortplant bij ongeveer 65°C en waarvan we hebben waargenomen dat hij ontkiemt, groeit en zwemt onder verwarming op microschaal; (ii) Thiobacillus sp., een optimaal hyperthermofiele archaea. bij 80°C. Dit werk maakt de weg vrij voor eenvoudige en veilige observatie van thermofiele micro-organismen met behulp van moderne en betaalbare microscopie-instrumenten.
Gedurende miljarden jaren is het leven op aarde geëvolueerd om zich aan te passen aan een breed scala aan omgevingsomstandigheden die vanuit ons menselijk perspectief soms als extreem worden beschouwd. In het bijzonder gedijen sommige thermofiele micro-organismen (bacteriën, archaea, schimmels), thermofielen genoemd, in het temperatuurbereik van 45°C tot 122°C1, 2, 3, 4. Thermofielen leven in verschillende ecosystemen, zoals hydrothermale bronnen in de diepzee, warmwaterbronnen of vulkanische gebieden. Hun onderzoek heeft de afgelopen decennia om minstens twee redenen veel belangstelling gewekt. Ten eerste kunnen we van hen bijvoorbeeld leren hoe thermofielen 5, 6, enzymen 7, 8 en membranen 9 stabiel zijn bij zulke hoge temperaturen, of hoe thermofielen extreme stralingsniveaus kunnen weerstaan10. Ten tweede vormen ze de basis voor veel belangrijke biotechnologische toepassingen1,11,12 zoals de productie van brandstoffen13,14,15,16, chemische synthese (dihydro, alcoholen, methaan, aminozuren, enz.)17, biomijnbouw18 en thermostabiele biokatalysatoren7,11, 13. In het bijzonder is bij de momenteel bekende polymerasekettingreactie (PCR)19 een enzym (Taq-polymerase) betrokken dat is geïsoleerd uit de thermofiele bacterie Thermus Aquaticus, een van de eerste thermofielen die is ontdekt.
De studie van thermofielen is echter geen gemakkelijke taak en kan in geen enkel biologisch laboratorium worden geïmproviseerd. In het bijzonder kunnen levende thermofielen in vitro niet worden waargenomen met welke standaard lichtmicroscoop dan ook, zelfs niet met in de handel verkrijgbare verwarmingskamers, die doorgaans geschikt zijn voor temperaturen zo laag als 40°C. Sinds de jaren negentig hebben slechts enkele onderzoeksgroepen zich toegelegd op de introductie van hogetemperatuurmicroscopiesystemen (HTM). In 1994 hebben Glukh et al. De verwarmings-/koelkamer is ontworpen op basis van het gebruik van een Peltier-cel die de temperatuur regelt van rechthoekige capillairen die gesloten zijn om de anaerobiciteit te behouden 20 . Het apparaat kan met een snelheid van 2 °C/s tot 100 °C worden verwarmd, waardoor de auteurs de beweeglijkheid van de hyperthermofiele bacterie Thermotoga maritima21 kunnen bestuderen. In 1999 hebben Horn et al. Er is een zeer vergelijkbaar apparaat ontwikkeld, nog steeds gebaseerd op het gebruik van verwarmde capillairen die geschikt zijn voor commerciële microscopie om celdeling/verbinding te bestuderen. Na een lange periode van relatieve inactiviteit werd de zoektocht naar effectieve HTM’s in 2012 hervat, met name in verband met een reeks artikelen van de Wirth-groep waarin gebruik werd gemaakt van een apparaat dat was uitgevonden door Horn et al. Vijftien jaar geleden werd de beweeglijkheid van een groot aantal archaea, waaronder hyperthermofielen, bestudeerd bij temperaturen tot 100 ° C met behulp van verwarmde haarvaten23,24. Ze hebben ook de originele microscoop aangepast om een snellere verwarming te bereiken (enkele minuten in plaats van 35 minuten om de ingestelde temperatuur te bereiken) en een lineaire temperatuurgradiënt van meer dan 2 cm over het medium te bereiken. Dit temperatuurgradiëntvormende apparaat (TGFD) is gebruikt om de mobiliteit van veel thermofielen binnen temperatuurgradiënten op biologisch relevante afstanden 24, 25 te bestuderen.
Het verwarmen van gesloten haarvaten is niet de enige manier om levende thermofielen te observeren. In 2012 hebben Kuwabara et al. Er werd gebruik gemaakt van zelfgemaakte wegwerpbare Pyrex-kamers, afgesloten met hittebestendige lijm (Super X2; Cemidine, Japan). De monsters werden op een in de handel verkrijgbare transparante verwarmingsplaat geplaatst (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Japan) die tot 110°C kon verwarmen, maar oorspronkelijk niet bedoeld voor bio-imaging. De auteurs observeerden een efficiënte verdeling van anaerobe thermofiele bacteriën (Thermosipho globiformans, verdubbelingstijd 24 min) bij 65°C. In 2020 hebben Pulshen et al. Efficiënte verwarming van commerciële metalen schalen (AttofluorTM, Thermofisher) werd gedemonstreerd met behulp van twee zelfgemaakte verwarmingselementen: een deksel en een podium (op een PCR-machine geïnspireerde configuratie). Deze associatie resulteert in een uniforme vloeistoftemperatuur en voorkomt verdamping en condensatie aan de onderkant van het deksel. Door het gebruik van een O-ring wordt gasuitwisseling met de omgeving vermeden. Deze HTM, de Sulfoscoop genaamd, werd gebruikt om Sulfolobus acidocaldarius in beeld te brengen bij 75°C27.
Een erkende beperking van al deze systemen was de beperking tot het gebruik van luchtobjectieven, aangezien elke onderdompeling in olie ongeschikt was voor zulke hoge temperaturen en voor beeldvorming door transparante monsters met een dikte van> 1 mm. Een erkende beperking van al deze systemen was de beperking tot het gebruik van luchtobjectieven, aangezien elke onderdompeling in olie ongeschikt was voor zulke hoge temperaturen en voor beeldvorming door transparante monsters met een dikte van> 1 mm. Zorg ervoor dat u geen gebruik meer kunt maken van de juiste hoeveelheid Als u dit wilt doen, kunt u dit niet doen уры en для визуализации через прозрачные образцы толщиной > 1 мм. Een erkende tekortkoming van al deze systemen was de beperking tot het gebruik van luchtdoelstellingen, aangezien elke onderdompeling in olie niet geschikt was voor zulke hoge temperaturen en voor visualisatie door transparante monsters > 1 mm dik.1毫米厚的透明样品成像。 Een erkende beperking van al deze systemen is de beperking van het gebruik van een luchtmeegevoerde spiegel, aangezien elke olie-immersie ongeschikt is voor het afbeelden van transparante monsters > 1 mm dik bij zulke hoge temperaturen. Общепризнанным недостатком всех этих систем является ограниченное использование воздушных объективов, любое иммерсионное погружение в масло непригодно для таких высоких температур и визуализации через прозрачные образцы толщиной >1 мм. Een erkend nadeel van al deze systemen is het beperkte gebruik van luchtlenzen, elke onderdompeling in olie is ongeschikt voor zulke hoge temperaturen en visualisatie door transparante monsters > 1 mm dik.Meer recentelijk werd deze beperking opgeheven door Charles-Orzag et al. 28, die een apparaat ontwikkelde dat niet langer warmte levert rond het betreffende systeem, maar eerder in het afdekglas zelf, bedekt met een dunne transparante laag van een weerstand gemaakt van ITO (indium-tinoxide). Het deksel kan tot 75 °C worden verwarmd door een elektrische stroom door de transparante laag te laten gaan. De auteur moet echter ook de lens tot aan het objectief verwarmen, maar niet meer dan 65 °C, om deze niet te beschadigen.
Deze werken laten zien dat de ontwikkeling van efficiënte optische microscopie bij hoge temperaturen nog niet op grote schaal is toegepast, vaak zelfgemaakte apparatuur vereist en vaak ten koste gaat van de ruimtelijke resolutie, wat een ernstig nadeel is gezien het feit dat thermofiele micro-organismen niet groter zijn dan een paar micrometer. Een lager verwarmingsvolume is de sleutel tot het oplossen van drie inherente problemen van HTM: slechte ruimtelijke resolutie, hoge thermische traagheid wanneer het systeem opwarmt, en schadelijke verwarming van omringende elementen (onderdompelingsolie, objectieflens… of de handen van de gebruiker) bij extreme temperaturen. ).
In dit artikel introduceren we een HTM voor thermofiele observatie die niet gebaseerd is op resistieve verwarming. In plaats daarvan bereikten we plaatselijke verwarming binnen een beperkt gebied van het gezichtsveld van de microscoop door laserbestraling van een lichtabsorberend substraat. De temperatuurverdeling werd gevisualiseerd met behulp van kwantitatieve fasemicroscopie (QPM). De effectiviteit van deze methode wordt aangetoond door Geobacillus stearothermophilus, een beweeglijke thermofiele bacterie die zich voortplant bij ongeveer 65°C en een korte verdubbelingstijd heeft (ongeveer 20 minuten), en Sulfolobus shibatae, een hyperthermofiel die optimaal groeit bij 80°C (archaea). illustreren. Normale replicatiesnelheid en zwemmen werden waargenomen als functie van de temperatuur. Deze laser-HTM (LA-HTM) wordt niet beperkt door de dikte van het dekglaasje of door de aard van het objectief (lucht- of olie-immersie). Hierdoor kan elke lens met hoge resolutie op de markt worden gebruikt. Het heeft ook geen last van langzame verwarming als gevolg van thermische traagheid (haalt onmiddellijke verwarming op millisecondenschaal op) en gebruikt alleen in de handel verkrijgbare componenten. De enige nieuwe veiligheidsproblemen houden verband met de aanwezigheid van krachtige laserstralen (doorgaans tot 100 mW) in het apparaat en mogelijk door de ogen, waarvoor een veiligheidsbril nodig is.
Het principe van LA-HTM is om een laser te gebruiken om het monster lokaal binnen het gezichtsveld van de microscoop te verwarmen (Fig. 1a). Om dit te doen, moet het monster lichtabsorberend zijn. Om een redelijk laservermogen (minder dan 100 mW) te gebruiken, vertrouwden we niet op de absorptie van licht door het vloeibare medium, maar verhoogden we de absorptie van het monster kunstmatig door het substraat te bedekken met gouden nanodeeltjes (figuur 1c). Het verwarmen van gouden nanodeeltjes met licht is van fundamenteel belang op het gebied van thermische plasmonica, met verwachte toepassingen in de biogeneeskunde, nanochemie of het oogsten van zonlicht29,30,31. De afgelopen jaren hebben we deze LA-HTM gebruikt in verschillende onderzoeken met betrekking tot thermische plasmatoepassingen in de natuurkunde, scheikunde en biologie. De grootste moeilijkheid bij deze methode is het weergeven van het uiteindelijke temperatuurprofiel, aangezien de verhoogde temperatuur beperkt is tot een microschaalgebied binnen het monster. We hebben aangetoond dat temperatuurkartering kan worden bereikt met de transversale afschuifinterferometer met vier golflengten, een eenvoudige, hoge resolutie en zeer gevoelige methode voor kwantitatieve fasemicroscopie gebaseerd op het gebruik van tweedimensionale diffractieroosters (ook bekend als kruisroosters) 33,34,35,36. De betrouwbaarheid van deze thermische microscopietechniek, gebaseerd op gekruiste roostergolffrontmicroscopie (CGM), is aangetoond in een tiental artikelen die de afgelopen tien jaar zijn gepubliceerd37,38,39,40,41,42,43.
Schema van installatie van parallelle laserverwarming, vormgeving en temperatuurmicroscoop. b Monstergeometrie bestaande uit een AttofluorTM-kamer met een dekglaasje bedekt met gouden nanodeeltjes. c Kijk goed naar het monster (niet op schaal). d vertegenwoordigt het uniforme laserstraalprofiel en (e) de gesimuleerde daaropvolgende temperatuurverdeling op het monstervlak van de gouden nanodeeltjes. f is een ringvormig laserstraalprofiel dat geschikt is voor het genereren van een uniforme temperatuur, zoals weergegeven in de simulatie van de resulterende temperatuurverdeling, weergegeven in (g). Schaalbalk: 30 µm.
In het bijzonder hebben we onlangs de verwarming van zoogdiercellen bereikt met LA-HTM en CGM en hebben we cellulaire hitteschokreacties in het bereik van 37-42 ° C gevolgd, wat de toepasbaarheid van deze techniek op beeldvorming van afzonderlijke levende cellen aantoont. De toepassing van LA-HTM op de studie van micro-organismen bij hoge temperaturen is echter niet eenduidig, omdat het meer voorzichtigheid vereist vergeleken met zoogdiercellen: ten eerste leidt het verwarmen van de bodem van het medium met tientallen graden (in plaats van een paar graden) tot tot een sterke verticale temperatuurgradiënt. kan vloeistofconvectie 44 creëren die, als deze niet stevig aan het substraat is bevestigd, ongewenste bewegingen en vermenging van bacteriën kan veroorzaken. Deze convectie kan worden geëlimineerd door de dikte van de vloeistoflaag te verminderen. Voor dit doel werden bij alle hieronder gepresenteerde experimenten bacteriële suspensies geplaatst tussen twee dekglaasjes van ongeveer 15 µm dik, geplaatst in een metalen beker (AttofluorTM, Thermofisher, figuur 1b, c). In principe kan convectie worden vermeden als de dikte van de vloeistof kleiner is dan de straalgrootte van de verwarmingslaser. Ten tweede kan het werken in een dergelijke beperkte geometrie aerobe organismen verstikken (zie figuur S2). Dit probleem kan worden vermeden door een substraat te gebruiken dat doorlaatbaar is voor zuurstof (of enig ander essentieel gas), door opgesloten luchtbellen in het dekglaasje achter te laten, of door gaten in het bovenste dekglaasje te boren (zie figuur S1) 45 . In deze studie kozen we voor de laatste oplossing (figuren 1b en S1). Ten slotte zorgt laserverwarming niet voor een uniforme temperatuurverdeling. Zelfs bij dezelfde intensiteit van de laserstraal (figuur 1d) is de temperatuurverdeling niet uniform, maar lijkt deze eerder op de Gaussische verdeling als gevolg van thermische diffusie (figuur 1e). Wanneer het doel is om precieze temperaturen in het gezichtsveld vast te stellen voor het bestuderen van biologische systemen, zijn ongelijke profielen niet ideaal en kunnen ze ook leiden tot thermoforetische beweging van bacteriën als ze zich niet aan het substraat hechten (zie Fig. S3, S4)39. Daartoe hebben we een ruimtelijke lichtmodulator (SLM) gebruikt om de infraroodlaserstraal vorm te geven volgens de vorm van de ring (Fig. 1f) in het vlak van het monster om een perfect uniforme temperatuurverdeling binnen een bepaald geometrisch gebied te bereiken, ondanks thermische diffusie (Fig. 1d) 39, 42, 46. Plaats een bovenste dekglaasje over een metalen schaal (Figuur 1b) om verdamping van het medium te voorkomen en observeer gedurende ten minste een paar dagen. Omdat dit bovendekglaasje niet is afgedicht, kan indien nodig op elk moment eenvoudig extra medium worden toegevoegd.
Om te illustreren hoe LA-HTM werkt en de toepasbaarheid ervan in thermofiel onderzoek aan te tonen, hebben we de aërobe bacterie Geobacillus stearothermophilus bestudeerd, die een optimale groeitemperatuur heeft van ongeveer 60-65°C. De bacterie heeft ook flagella en het vermogen om te zwemmen, wat een andere indicator is voor normale cellulaire activiteit.
Monsters (Fig. lb) werden gedurende één uur bij 60°C voorgeïncubeerd en vervolgens in een LA-HTM-monsterhouder geplaatst. Deze pre-incubatie is optioneel, maar nog steeds nuttig, om twee redenen: ten eerste, wanneer de laser wordt ingeschakeld, zorgt deze ervoor dat de cellen onmiddellijk groeien en delen (zie film M1 in aanvullende materialen). Zonder pre-incubatie wordt de bacteriegroei doorgaans met ongeveer 40 minuten vertraagd telkens wanneer een nieuw kijkgebied op het monster wordt verwarmd. Ten tweede bevorderde de pre-incubatie van 1 uur de hechting van de bacteriën aan het dekglaasje, waardoor werd voorkomen dat cellen uit het gezichtsveld dreven als gevolg van thermoforese wanneer de laser werd ingeschakeld (zie film M2 in aanvullende materialen). Thermoforese is de beweging van deeltjes of moleculen langs een temperatuurgradiënt, meestal van warm naar koud, en bacteriën vormen hierop geen uitzondering43,47. Dit ongewenste effect wordt over een bepaald gebied geëlimineerd door SLM te gebruiken om de laserstraal vorm te geven en een vlakke temperatuurverdeling te bereiken.
Op afb. Figuur 2 toont de temperatuurverdeling gemeten door CGM, verkregen door een glassubstraat bedekt met gouden nanodeeltjes te bestralen met een ringvormige laserstraal (figuur 1f). Er werd een vlakke temperatuurverdeling waargenomen over het gehele gebied dat door de laserstraal werd bestreken. Deze zone werd ingesteld op 65°C, de optimale groeitemperatuur. Buiten dit gebied daalt de temperatuurcurve uiteraard naar \(1/r\) (waarbij \(r\) de radiale coördinaat is).
een temperatuurkaart van CGM-metingen verkregen door een ringvormige laserstraal te gebruiken om een laag gouden nanodeeltjes te bestralen om een vlak temperatuurprofiel over een cirkelvormig gebied te verkrijgen. b Isotherm van de temperatuurkaart (a). De contour van de laserstraal wordt weergegeven door een grijze gestippelde cirkel. Het experiment werd tweemaal herhaald (zie aanvullende materialen, figuur S4).
De levensvatbaarheid van bacteriële cellen werd gedurende enkele uren gevolgd met behulp van LA-HTM. Op afb. 3 toont het tijdsinterval voor vier beelden uit een film van 3 uur en 20 minuten (film M3, aanvullende informatie). Er werd waargenomen dat bacteriën zich actief vermenigvuldigen binnen het cirkelvormige gebied dat door de laser wordt gedefinieerd, waar de temperatuur optimaal was, bijna 65°C. Daarentegen werd de celgroei aanzienlijk verminderd als de temperatuur gedurende 10 seconden onder de 50°C daalde.
Optische dieptebeelden van G. stearothermophilus-bacteriën die groeien na laserverwarming op verschillende tijdstippen, (a) t = 0 min, (b) 1 uur 10 min, (c) 2 uur 20 min, (d) 3 uur 20 min, buiten 200 Geëxtraheerd uit een film van één minuut (M3-film verstrekt in aanvullende informatie) bovenop de overeenkomstige temperatuurkaart. De laser wordt ingeschakeld op tijdstip \(t=0\). Er zijn isothermen toegevoegd aan het intensiteitsbeeld.
Om de celgroei en de afhankelijkheid ervan van de temperatuur verder te kwantificeren, hebben we de toename in biomassa van verschillende kolonies van aanvankelijk geïsoleerde bacteriën gemeten in het gezichtsveld van Movie M3 (Fig. 4). De ouderbacteriën die zijn geselecteerd aan het begin van de vorming van de minikolonievormende eenheid (mCFU) worden weergegeven in Figuur S6. Droge massametingen werden uitgevoerd met een CGM 48-camera waarmee de temperatuurverdeling in kaart werd gebracht. Het vermogen van de CGM om het drooggewicht en de temperatuur te meten is de kracht van de LA-HTM. Zoals verwacht veroorzaakte hoge temperatuur een snellere bacteriegroei (Fig. 4a). Zoals weergegeven in de semi-loggrafiek in figuur 4b volgt de groei bij alle temperaturen de exponentiële groei, waarbij de gegevens de exponentiële functie \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ gebruiken {{ \mbox{cst}}}\), waarbij \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – generatietijd (of verdubbelingstijd), \( g =1/ \tau\) – groeisnelheid (aantal delingen per tijdseenheid). Op afb. 4c toont de respectieve groeisnelheid en generatietijd als functie van de temperatuur. Snelgroeiende mCFU's worden gekenmerkt door verzadiging van de groei na twee uur, een verwacht gedrag als gevolg van de hoge bacteriedichtheid (vergelijkbaar met de stationaire fase in klassieke vloeibare culturen). De algemene vorm \(g\left(T\right)\) (Fig. 4c) komt overeen met de verwachte tweefasencurve voor G. stearothermophilus met een optimale groeisnelheid rond 60-65°C. Match de gegevens met behulp van een kardinaal model (Figuur S5)49 waarbij \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, wat goed overeenkomt met andere waarden die in de literatuur worden genoemd49. Hoewel de temperatuurafhankelijke parameters reproduceerbaar zijn, kan de maximale groeisnelheid van \({G}_{0}\) van experiment tot experiment variëren (zie figuren S7-S9 en film M4). In tegenstelling tot temperatuuraanpassingsparameters, die universeel zouden moeten zijn, hangt de maximale groeisnelheid af van de eigenschappen van het medium (beschikbaarheid van voedingsstoffen, zuurstofconcentratie) binnen de waargenomen geometrie op microschaal.
a Microbiële groei bij verschillende temperaturen. mCFU: miniatuurkolonievormende eenheden. Gegevens verkregen uit een video van een enkele bacterie die groeit in een temperatuurgradiënt (film M3). b Hetzelfde als (a), semi-logaritmische schaal. c Groeisnelheid\(\tau\) en generatietijd\(g\) berekend op basis van lineaire regressie (b). Horizontale foutbalken: temperatuurbereik waarover mCFU's zich tijdens de groei in het gezichtsveld uitbreidden. Verticale foutbalken: standaardfout van lineaire regressie.
Naast de normale groei kwamen sommige bacteriën soms in beeld tijdens laserverwarming, wat een verwacht gedrag is voor bacteriën met flagella. Het filmpje M5 met aanvullende informatie toont dergelijke zwemactiviteiten. In dit experiment werd uniforme laserstraling gebruikt om een temperatuurgradiënt te creëren, zoals weergegeven in figuren 1d, e en S3. Figuur 5 toont twee beeldsequenties geselecteerd uit de M5-film, waaruit blijkt dat één bacterie directionele beweging vertoont terwijl alle andere bacteriën bewegingloos blijven.
De twee tijdsbestekken (a) en (b) tonen het zwemmen van twee verschillende bacteriën, gemarkeerd met gestippelde cirkels. De afbeeldingen zijn afkomstig uit de M5-film (aangeleverd als aanvullend materiaal).
In het geval van G. stearothermophilus begon de actieve beweging van bacteriën (Fig. 5) een paar seconden nadat de laserstraal was ingeschakeld. Deze waarneming benadrukt de temporele reactie van dit thermofiele micro-organisme op een temperatuurstijging, zoals reeds waargenomen door Mora et al. 24. Het onderwerp bacteriële motiliteit en zelfs thermotaxis kan verder worden onderzocht met behulp van LA-HTM.
Microbieel zwemmen moet niet worden verward met andere vormen van fysieke beweging, namelijk (i) Brownse beweging, die een chaotische beweging lijkt te zijn zonder duidelijke richting, (ii) convectie 50 en thermoforese 43, bestaande uit een regelmatige beweging langs een bepaalde temperatuur. gradiënt.
G. stearothermophilus staat bekend om zijn vermogen om zeer resistente sporen te produceren (sporenvorming) bij blootstelling aan ongunstige omgevingsomstandigheden als verdediging. Wanneer de omgevingsomstandigheden weer gunstig worden, ontkiemen de sporen, vormen levende cellen en hervatten de groei. Hoewel dit sporulatie-/kiemproces algemeen bekend is, is het nog nooit in realtime waargenomen. Met behulp van LA-HTM rapporteren we hier de eerste waarneming van kiemgebeurtenissen bij G. stearothermophilus.
Op afb. 6a toont time-lapse-beelden van optische diepte (OT) verkregen met behulp van een CGM-set van 13 sporen. Gedurende de gehele verzameltijd (15 uur en 6 minuten, \(t=0\) – het begin van de laserverwarming) ontkiemden 4 van de 13 sporen, op opeenvolgende tijdstippen \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' en \(11\) h \(30\)'. Hoewel slechts één van deze gebeurtenissen wordt getoond in figuur 6, kunnen er in het aanvullende materiaal vier kiemgebeurtenissen worden waargenomen in de M6-film. Interessant genoeg lijkt de kieming willekeurig te zijn: niet alle sporen ontkiemen en ontkiemen niet tegelijkertijd, ondanks dezelfde veranderingen in de omgevingsomstandigheden.
een time-lapse bestaande uit 8 OT-beelden (olie-immersie, 60x, 1,25 NA-doelstelling) en (b) biomassa-evolutie van G. stearothermophilus-aggregaten. c (b) Getekend op een semi-logaritmische schaal om de lineariteit van de groeisnelheid te benadrukken (stippellijn).
Op afb. 6b,c toont de biomassa van celpopulaties in het gezichtsveld als functie van de tijd over de gehele periode van gegevensverzameling. Het snelle verval van de droge massa waargenomen bij \(t=5\)h in Fig. 6b, c, vanwege het verlaten van sommige cellen uit het gezichtsveld. De groeisnelheid van deze vier gebeurtenissen is \(0,77\pm 0,1\) h-1. Deze waarde is hoger dan de groeisnelheid die hoort bij Figuur 3.3 en 4, waar cellen normaal groeien. De reden voor de verhoogde groeisnelheid van G. stearothermophilus uit sporen is onduidelijk, maar deze metingen benadrukken de interesse van LA-HTM en werken op het niveau van individuele cellen (of op het niveau van enkele mCFU) om meer te leren over de dynamiek van het celleven. .
Om de veelzijdigheid van LA-HTM en zijn prestaties bij hoge temperaturen verder aan te tonen, onderzochten we de groei van Sulfolobus shibatae, een hyperthermofiele acidofiele archaea met een optimale groeitemperatuur van 80°C51. Vergeleken met G. stearothermophilus hebben deze archaea ook een heel andere morfologie, die eerder lijkt op bollen van 1 micron (kokken) dan op langwerpige staafjes (bacillen).
Figuur 7a bestaat uit opeenvolgende optische dieptebeelden van S. shibatae mCFU verkregen met behulp van CGM (zie M7-speelfilm in aanvullende materialen). Deze mCFU groeit bij ongeveer 73°C, onder de optimale temperatuur van 80°C, maar binnen het temperatuurbereik voor actieve groei. We hebben meerdere splijtingsgebeurtenissen waargenomen waardoor mCFU's na een paar uur op microdruiven van archaea leken. Uit deze OT-beelden werd de mCFU-biomassa in de loop van de tijd gemeten en weergegeven in figuur 7b. Interessant is dat de mCFU's van S. shibatae lineaire groei vertoonden in plaats van de exponentiële groei die werd waargenomen bij mCFU's van G. stearothermophilus. Er bestaat al lang een discussie 52 over de aard van de celgroeisnelheid: terwijl sommige onderzoeken de groeisnelheid van microben rapporteren die evenredig is aan hun omvang (exponentiële groei), laten andere een constante snelheid zien (lineaire of bilineaire groei). Zoals uitgelegd door Tzur et al.53 vereist het onderscheid tussen exponentiële en (bi)lineaire groei een precisie van <6% bij biomassametingen, wat buiten bereik is voor de meeste QPM-technieken, zelfs als het gaat om interferometrie. Zoals uitgelegd door Tzur et al.53 vereist het onderscheid tussen exponentiële en (bi)lineaire groei een precisie van <6% bij biomassametingen, wat buiten bereik is voor de meeste QPM-technieken, zelfs als het gaat om interferometrie. Als je naar Цур en др.53 kijkt, kun je meer dan 6% verwachten Als u een QPM-apparaat gebruikt, kunt u dit doen метрии. Zoals uitgelegd door Zur et al.53 vereist het onderscheid tussen exponentiële en (bi)lineaire groei een nauwkeurigheid van <6% bij biomassametingen, wat onhaalbaar is voor de meeste QPM-methoden, zelfs met behulp van interferometrie.Zoals uitgelegd door Zur et al. 53 vereist het onderscheid tussen exponentiële en (bi)lineaire groei een nauwkeurigheid van minder dan 6% bij biomassametingen, wat voor de meeste QPM-methoden onhaalbaar is, zelfs als interferometrie wordt gebruikt. CGM bereikt deze nauwkeurigheid met een nauwkeurigheid van sub-pg bij metingen van biomassa36,48.
een time-lapse bestaande uit 6 OT-beelden (olie-immersie, 60x, NA-doelstelling 1,25) en (b) evolutie van micro-CFU-biomassa gemeten met CGM. Zie film M7 voor meer informatie.
De perfect lineaire groei van S. shibatae was onverwacht en is nog niet gerapporteerd. Er wordt echter exponentiële groei verwacht, tenminste omdat er in de loop van de tijd meerdere delingen van 2, 4, 8, 16 … cellen moeten plaatsvinden. Onze hypothese was dat lineaire groei te wijten zou kunnen zijn aan celremming als gevolg van dichte celpakking, net zoals de celgroei vertraagt en uiteindelijk een slapende toestand bereikt wanneer de celdichtheid te hoog is.
We sluiten af door achtereenvolgens de volgende vijf aandachtspunten te bespreken: vermindering van het verwarmingsvolume, vermindering van de thermische traagheid, interesse in gouden nanodeeltjes, interesse in kwantitatieve fasemicroscopie en een mogelijk temperatuurbereik waarin LA-HTM kan worden gebruikt.
Vergeleken met resistieve verwarming biedt laserverwarming die wordt gebruikt voor HTM-ontwikkeling verschillende voordelen, die we in deze studie illustreren. Met name in vloeibare media in het gezichtsveld van de microscoop wordt het verwarmingsvolume binnen enkele (10 μm) 3 volumes gehouden. Op deze manier zijn alleen de waargenomen microben actief, terwijl andere bacteriën inactief zijn en kunnen worden gebruikt om het monster verder te bestuderen – het is niet nodig om het monster elke keer te vervangen als een nieuwe temperatuur moet worden gecontroleerd. Bovendien maakt verwarming op microschaal een direct onderzoek van een groot temperatuurbereik mogelijk: figuur 4c is verkregen uit een 3 uur durende film (film M3), waarvoor doorgaans de voorbereiding en het onderzoek van verschillende monsters nodig is – één voor elk van de onderzochte monsters. y is de temperatuur die het aantal dagen in het experiment vertegenwoordigt. Het verminderen van het verwarmde volume houdt ook alle omringende optische componenten van de microscoop, vooral de objectieflens, op kamertemperatuur, wat tot nu toe een groot probleem is geweest waar de gemeenschap mee te maken heeft. LA-HTM kan worden gebruikt met elke lens, inclusief olie-immersielenzen, en blijft op kamertemperatuur, zelfs bij extreme temperaturen in het gezichtsveld. De belangrijkste beperking van de laserverwarmingsmethode die we in dit onderzoek rapporteren, is dat cellen die niet hechten of drijven, zich mogelijk ver buiten het gezichtsveld bevinden en moeilijk te bestuderen zijn. Een oplossing zou kunnen zijn om lenzen met een lage vergroting te gebruiken om een grotere temperatuurstijging van meer dan een paar honderd micron te bereiken. Deze voorzichtigheid gaat gepaard met een afname van de ruimtelijke resolutie, maar als het doel is om de beweging van micro-organismen te bestuderen, is een hoge ruimtelijke resolutie niet vereist.
De tijdschaal voor het verwarmen (en koelen) van het systeem \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) hangt af van de grootte ervan, volgens de wet \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), waarbij \ (L\ ) is de karakteristieke grootte van de warmtebron (de diameter van de laserstraal in ons onderzoek is \(L\ ongeveer 100\) μm), \(D\) is de thermische diffusiviteit van de omgeving (gemiddeld in onze doos, glas en water Diffusiesnelheid\(D\ ongeveer 2\voudig {10}^{-7}\) m2/s). Daarom zijn in dit onderzoek tijdreacties in de orde van 50 ms, dat wil zeggen quasi-onmiddellijk temperatuurveranderingen kunnen worden verwacht. Deze onmiddellijke vaststelling van temperatuurstijging verkort niet alleen de duur van het experiment, maar maakt ook een nauwkeurige timing \(t=0\) mogelijk voor elke dynamische studie van temperatuureffecten.
Onze voorgestelde methode is toepasbaar op elk lichtabsorberend substraat (bijvoorbeeld commerciële monsters met ITO-coating). Gouden nanodeeltjes kunnen echter zorgen voor een hoge absorptie in het infrarood en een lage absorptie in het zichtbare bereik, waarvan de laatste kenmerken van belang zijn voor effectieve optische observatie in het zichtbare bereik, vooral bij gebruik van fluorescentie. Bovendien is goud biocompatibel, chemisch inert, kan de optische dichtheid worden aangepast van 530 nm tot nabij-infrarood, en is de monstervoorbereiding eenvoudig en economisch29.
Transversale roostergolffrontmicroscopie (CGM) maakt niet alleen het in kaart brengen van de temperatuur op microschaal mogelijk, maar ook het monitoren van biomassa, waardoor dit bijzonder nuttig (zo niet noodzakelijk) is in combinatie met LA-HTM. In het afgelopen decennium zijn andere technieken voor temperatuurmicroscopie ontwikkeld, vooral op het gebied van bioimaging, en de meeste daarvan vereisen het gebruik van temperatuurgevoelige fluorescerende sondes54,55. Deze methoden zijn echter bekritiseerd en in sommige rapporten zijn onrealistische temperatuurveranderingen in cellen gemeten, mogelijk als gevolg van het feit dat fluorescentie van veel andere factoren dan temperatuur afhangt. Bovendien zijn de meeste fluorescentiesondes onstabiel bij hoge temperaturen. Daarom vertegenwoordigen QPM en in het bijzonder CGM een ideale temperatuurmicroscopietechniek voor het bestuderen van het leven bij hoge temperaturen met behulp van optische microscopie.
Studies van S. shibatae, die optimaal leven bij 80°C, tonen aan dat LA-HTM kan worden toegepast om hyperthermofielen te bestuderen, niet alleen eenvoudige thermofielen. In principe is er geen limiet aan het temperatuurbereik dat kan worden bereikt met behulp van LA-HTM, en zelfs temperaturen boven 100°C kunnen worden bereikt bij atmosferische druk zonder te koken, zoals aangetoond door onze groep van 38 in hydrothermische chemietoepassingen bij atmosferische druk. druk A. Een laser wordt op dezelfde manier gebruikt voor het verwarmen van gouden nanodeeltjes 40. LA-HTM heeft dus het potentieel om te worden gebruikt om ongekende hyperthermofielen te observeren met standaard optische microscopie met hoge resolutie onder standaardomstandigheden (dwz onder omgevingsstress).
Alle experimenten werden uitgevoerd met behulp van een zelfgemaakte microscoop, inclusief Köhler-verlichting (met LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), preparaathouder met handmatige xy-beweging, objectieven (Olympus, 60x, 0,7 NA, lucht, LUCPlanFLN60X of 60x, 1,25 NA, olie , UPLFLN60XOI), CGM-camera (QLSI-kruisrooster, 39 µm pitch, 0,87 mm van Andor Zyla-camerasensor) voor beeldvorming van intensiteit en golffront, en sCMOS-camera (ORCA Flash 4.0 V3, 16-bit-modus, van Hamamatsu) om de gegevens getoond in Figuur 5 (bacterieel zwemmen). De dichroïsche bundelsplitser is een BrightLine-rand van 749 nm (Semrock, FF749-SDi01). Het filter aan de voorzijde van de camera is een 694 short pass filter (FF02-694/SP-25, Semrock). Titaniumsaffierlaser (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, gepompte tsunami-laserholte, Spectra-Physics in figuur 2-5, verder vervangen door Millenia-laser, Spectraphysics 10 W, gepompte Mira-laserholte, Coherent, voor figuur 2 -5). 6 en 7) zijn ingesteld op de golflengte \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm, wat overeenkomt met het plasmonresonantiespectrum van gouden nanodeeltjes. Ruimtelijke lichtmodulatoren (1920 × 1152 pixels) zijn gekocht bij Meadowlark Optics. De hologrammen zijn berekend met behulp van het Gerchberg-Saxton-algoritme zoals beschreven in link 39.
Cross grating wavefront microscopie (CGM) is een optische microscopietechniek gebaseerd op het combineren van een tweedimensionaal diffractierooster (ook bekend als kruisrooster) op een afstand van één millimeter van de sensor van een conventionele camera. Het meest voorkomende voorbeeld van een CGM dat we in dit onderzoek hebben gebruikt, wordt een transversale shift-interferometer (QLSI) met vier golflengten genoemd, waarbij het kruisrooster bestaat uit een intensiteit/fase schaakbordpatroon geïntroduceerd en gepatenteerd door Primot et al. in 200034. De verticale en horizontale roosterlijnen creëren rasterachtige schaduwen op de sensor, waarvan de vervorming in realtime numeriek kan worden verwerkt om de optische golffrontvervorming (of een gelijkwaardig faseprofiel) van het invallende licht te verkrijgen. Bij gebruik op een microscoop kan een CGM-camera het optische padverschil van een afgebeeld object weergeven, ook wel optische diepte (OT) genoemd, met een gevoeligheid in de orde van nanometers36. Om eventuele defecten in de optische componenten of bundels te elimineren, moet bij elke CGM-meting een primair referentie-OT-beeld worden genomen en van eventuele daaropvolgende beelden worden afgetrokken.
Temperatuurmicroscopie werd uitgevoerd met behulp van een CGM-camera zoals beschreven in de referentie. 32. Kortom, het verwarmen van een vloeistof verandert de brekingsindex ervan, waardoor een thermisch lenseffect ontstaat dat de invallende straal vervormt. Deze golffrontvervorming wordt gemeten door de CGM en verwerkt met behulp van een deconvolutie-algoritme om een driedimensionale temperatuurverdeling in het vloeibare medium te verkrijgen. Als de gouden nanodeeltjes gelijkmatig door het monster zijn verdeeld, kunnen temperatuurkarteringen worden uitgevoerd in bacterievrije gebieden om betere beelden te produceren, wat we soms doen. Het referentie-CGM-beeld werd zonder verwarming verkregen (met de laser uit) en vervolgens op dezelfde locatie in het beeld vastgelegd met de laser aan.
Meting van de droge massa wordt uitgevoerd met behulp van dezelfde CGM-camera die wordt gebruikt voor temperatuurbeeldvorming. CGM-referentiebeelden werden verkregen door het monster tijdens de blootstelling snel in x en y te verplaatsen als een middel om eventuele inhomogeniteit in de OT als gevolg van de aanwezigheid van bacteriën te middelen. Uit OT-beelden van bacteriën werd hun biomassa verkregen met behulp van een ensemble van beelden over gebieden geselecteerd met behulp van Matlab's zelfgemaakte segmentatie-algoritme (zie subsectie "Numerieke code"), volgens de procedure beschreven in ref. 48. Kort gezegd gebruiken we de relatie \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), waarbij \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) het optische dieptebeeld is, \(m\) is het drooggewicht en \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) is een constante. We kozen voor \({{{\rm{\alpha))))))=0,18\) µm3/pg, wat een typische constante is voor levende cellen.
Een dekglaasje met een diameter van 25 mm en een dikte van 150 µm bedekt met gouden nanodeeltjes werd in een AttofluorTM-kamer (Thermofisher) geplaatst met de gouden nanodeeltjes naar boven gericht. Geobacillus stearothermophilus werd vóór elke dag van de experimenten een nacht voorgekweekt in LB-medium (200 rpm, 60°C). Een druppel van 5 µl van een suspensie van G. stearothermophilus met een optische dichtheid (OD) van 0,3 tot 0,5 werd op een dekglaasje met gouden nanodeeltjes geplaatst. Vervolgens werd een rond dekglaasje met een diameter van 18 mm en een gat met een diameter van 5 mm in het midden op de druppel gevallen en werd herhaaldelijk 5 μl bacteriële suspensie met dezelfde optische dichtheid op het midden van het gat aangebracht. De putjes op dekglaasjes werden bereid in overeenstemming met de procedure beschreven in ref. 45 (zie aanvullende informatie voor meer informatie). Voeg vervolgens 1 ml LB-medium toe aan het dekglaasje om te voorkomen dat de vloeistoflaag uitdroogt. Het laatste dekglaasje wordt over het gesloten deksel van de Attofluor™-kamer geplaatst om verdamping van het medium tijdens de incubatie te voorkomen. Voor ontkiemingsexperimenten gebruikten we sporen, die, na conventionele experimenten, soms het bovenste dekglaasje bedekten. Een soortgelijke methode werd gebruikt om Sulfolobus shibatae te verkrijgen. Drie dagen (200 rpm, 75°C) van voorafgaande kweek van Thiobacillus serrata werden uitgevoerd in medium 182 (DSMZ).
Monsters van gouden nanodeeltjes werden bereid door micellaire blokcopolymeerlithografie. Dit proces wordt in detail beschreven in hoofdstuk. 60. In het kort werden micellen die goudionen inkapselen gesynthetiseerd door het copolymeer te mengen met HAuCl4 in tolueen. De gereinigde dekglaasjes werden vervolgens ondergedompeld in de oplossing en behandeld met UV-bestraling in aanwezigheid van een reductiemiddel om goudzaden te verkrijgen. Ten slotte werden goudzaden gekweekt door een dekglaasje gedurende 16 minuten in contact te brengen met een waterige oplossing van KAUCl4 en ethanolamine, wat resulteerde in een quasi-periodieke en zeer uniforme rangschikking van niet-sferische gouden nanodeeltjes in het nabij-infrarood.
Om de interferogrammen naar OT-beelden om te zetten, hebben we een zelfgemaakt algoritme gebruikt, zoals beschreven in de link. 33 en is beschikbaar als Matlab-pakket in de volgende openbare repository: https://github.com/baffou/CGMprocess. Het pakket kan intensiteit en OT-beelden berekenen op basis van opgenomen interferogrammen (inclusief referentiebeelden) en camera-array-afstanden.
Om het op SLM toegepaste fasepatroon te berekenen om een bepaald temperatuurprofiel te verkrijgen, hebben we een eerder ontwikkeld zelfgemaakt algoritme39,42 gebruikt dat beschikbaar is in de volgende openbare repository: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. De invoer is het gewenste temperatuurveld, dat digitaal of via een monochrome bmp-afbeelding kan worden ingesteld.
Om de cellen te segmenteren en hun drooggewicht te meten, hebben we ons Matlab-algoritme gebruikt, gepubliceerd in de volgende openbare repository: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Op elke afbeelding moet de gebruiker op de gewenste bacterie of mCFU klikken, de gevoeligheid van de staaf aanpassen en de selectie bevestigen.
Voor meer informatie over het ontwerp van onderzoeken, zie de samenvatting van het Nature Research Report, gekoppeld aan dit artikel.
Gegevens die de resultaten van dit onderzoek ondersteunen, zijn op redelijk verzoek verkrijgbaar bij de respectieve auteurs.
De broncode die in dit onderzoek wordt gebruikt, wordt gedetailleerd beschreven in de sectie Methoden, en foutopsporingsversies kunnen worden gedownload van https://github.com/baffou/ in de volgende opslagplaatsen: SLM_temperatureShaping, CGMprocess en CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Inzicht in thermofielen en hun breedspectrumtoepassingen. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Inzicht in thermofielen en hun breedspectrumtoepassingen.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. en Sharma, AK Overzicht van thermofielen en hun brede toepassing. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. en Sharma AK Een diep begrip van thermofielen en een breed scala aan toepassingen.3 Biotechnologie 6, 81 (2016).
Posttijd: 26 september 2022