Bij de ziekte van Alzheimer (AD) ontbreken eiwitbiomarkers die de meerdere onderliggende pathofysiologie weerspiegelen, waardoor de voortgang van diagnose en behandeling wordt belemmerd. Hier gebruiken we uitgebreide proteomics om biomarkers voor hersenvocht (CSF) te identificeren die een breed scala aan AD-pathofysiologie vertegenwoordigen. Multiplex massaspectrometrie identificeerde respectievelijk ongeveer 3.500 en ongeveer 12.000 eiwitten in AD CSF en de hersenen. De netwerkanalyse van het hersenproteoom loste 44 biodiversiteitsmodules op, waarvan er 15 overlapten met het proteoom van het hersenvocht. De CSF AD-markers in deze overlappende modules zijn gevouwen in vijf eiwitgroepen, die verschillende pathofysiologische processen vertegenwoordigen. De synapsen en metabolieten in de AD-hersenen nemen af, maar de CSF neemt toe, terwijl de gliale rijke myelinisatie- en immuungroepen in de hersenen en CSF toenemen. De consistentie en ziektespecificiteit van de panelveranderingen werden bevestigd in meer dan 500 extra CSF-monsters. Deze groepen identificeerden ook biologische subgroepen bij asymptomatische AD. Over het geheel genomen zijn deze resultaten een veelbelovende stap in de richting van webgebaseerde biomarkerhulpmiddelen voor klinische toepassingen bij de ziekte van Alzheimer.
De ziekte van Alzheimer (AD) is wereldwijd de meest voorkomende oorzaak van neurodegeneratieve dementie en wordt gekenmerkt door een breed scala aan disfuncties van het biologische systeem, waaronder synaptische transmissie, gliale-gemedieerde immuniteit en mitochondriaal metabolisme (1-3). De gevestigde eiwitbiomarkers zijn echter nog steeds gericht op het detecteren van amyloïde- en tau-eiwit en kunnen daarom deze diverse pathofysiologie niet weerspiegelen. Deze ‘kern’-eiwitbiomarkers die het meest betrouwbaar worden gemeten in hersenvocht (CSF) omvatten (i) amyloïde bèta-peptide 1-42 (Aβ1-42), dat de vorming van corticale amyloïde plaques weerspiegelt; (ii) totaal tau, een teken van axondegeneratie; (iii) fosfo-tau (p-tau), een vertegenwoordiger van pathologische tau-hyperfosforylering (4-7). Hoewel deze biomarkers voor het hersenvocht onze detectie van ‘gemarkeerde’ AD-eiwitziekten enorm hebben vergemakkelijkt (4-7), vertegenwoordigen ze slechts een klein deel van de complexe biologie achter de ziekte.
Het gebrek aan pathofysiologische diversiteit van AD-biomarkers heeft tot veel uitdagingen geleid, waaronder (i) het onvermogen om de biologische heterogeniteit van AD-patiënten te identificeren en te kwantificeren, (ii) onvoldoende meting van de ernst en progressie van de ziekte, vooral in de preklinische fase, en (ii) iii) de ontwikkeling van therapeutische medicijnen die er niet in slaagden alle aspecten van neurologische achteruitgang volledig op te lossen. Onze afhankelijkheid van historische pathologie om AD te beschrijven van gerelateerde ziekten verergert deze problemen alleen maar. Steeds meer bewijzen tonen aan dat de meeste ouderen met dementie meer dan één pathologisch kenmerk van cognitieve achteruitgang hebben (8). Maar liefst 90% of meer van de personen met AD-pathologie heeft ook vaatziekten, TDP-43-insluitsels of andere degeneratieve ziekten (9). Deze hoge mate van pathologische overlap heeft ons huidige diagnostische raamwerk voor dementie verstoord, en er is een meer omvattende pathofysiologische definitie van de ziekte nodig.
Met het oog op de dringende behoefte aan een verscheidenheid aan AD-biomarkers, maakt het veld steeds meer gebruik van de “omics”-methode, gebaseerd op het algemene systeem om biomarkers te ontdekken. De Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD Alliance werd in 2014 gelanceerd en loopt voorop in het programma. Deze multidisciplinaire inspanning van de National Institutes of Health, de academische wereld en de industrie heeft tot doel systeemgebaseerde strategieën te gebruiken om de pathofysiologie van AD beter te definiëren en diagnostische analyses en behandelingsstrategieën voor biodiversiteit te ontwikkelen (10). Als onderdeel van dit project is netwerkproteomics een veelbelovend hulpmiddel geworden voor de vooruitgang van systeemgebaseerde biomarkers bij AD. Deze onbevooroordeelde datagestuurde aanpak organiseert complexe proteomics-datasets in groepen of ‘modules’ van tot co-expressie gebrachte eiwitten die geassocieerd zijn met specifieke celtypen, organellen en biologische functies (11-13). Er zijn bijna twaalf informatierijke netwerkproteomics-onderzoeken uitgevoerd naar de AD-hersenen (13-23). Over het geheel genomen geven deze analyses aan dat het proteoom van het AD-hersennetwerk een zeer geconserveerde modulaire organisatie handhaaft in onafhankelijke cohorten en meerdere corticale regio's. Bovendien vertonen sommige van deze modules reproduceerbare veranderingen in AD-gerelateerde overvloed in datasets, wat de pathofysiologie van meerdere ziekten weerspiegelt. Gezamenlijk demonstreren deze bevindingen een veelbelovend ankerpunt voor de ontdekking van het hersennetwerkproteoom als een systeemgebaseerde biomarker bij AD.
Om het proteoom van het AD-hersennetwerk te transformeren in klinisch bruikbare systeemgebaseerde biomarkers, combineerden we het van de hersenen afgeleide netwerk met de proteomische analyse van AD CSF. Deze geïntegreerde aanpak leidde tot de identificatie van vijf veelbelovende sets CSF-biomarkers die geassocieerd zijn met een breed scala aan op de hersenen gebaseerde pathofysiologie, waaronder synapsen, bloedvaten, myelinisatie, ontsteking en disfunctie van metabolische routes. We hebben deze biomarkerpanels met succes gevalideerd door middel van meerdere replicatieanalyses, waaronder meer dan 500 CSV-monsters van verschillende neurodegeneratieve ziekten. Deze validatieanalyses omvatten het onderzoeken van groepsdoelen in het hersenvocht van patiënten met asymptomatische AD (AsymAD) of het aantonen van bewijs van abnormale amyloïdeaccumulatie in een normale cognitieve omgeving. Deze analyses benadrukken de significante biologische heterogeniteit in de AsymAD-populatie en identificeren panelmarkers die mogelijk individuen in de vroegste stadia van de ziekte kunnen subtyperen. Over het geheel genomen vertegenwoordigen deze resultaten een belangrijke stap in de ontwikkeling van eiwitbiomarkerhulpmiddelen op basis van meerdere systemen die met succes veel van de klinische uitdagingen waarmee AD wordt geconfronteerd, kunnen oplossen.
Het belangrijkste doel van deze studie is het identificeren van nieuwe biomarkers voor het hersenvocht die verschillende op de hersenen gebaseerde pathofysiologie weerspiegelen die tot AD leiden. Figuur S1 schetst onze onderzoeksmethodologie, die (i) een uitgebreide analyse omvat, aangestuurd door voorlopige bevindingen van AD CSF en het netwerkhersenproteoom om meerdere hersengerelateerde biomarkers voor CSF-ziekten te identificeren, en (ii) daaropvolgende replicatie. Deze biomarkers bevinden zich in verschillende onafhankelijke cerebrospinale vloeiende cohorten. Het op ontdekkingen gerichte onderzoek begon met de analyse van de differentiële expressie van hersenvocht bij 20 cognitief normale individuen en 20 AD-patiënten in het Emory Goizueta Alzheimer's Disease Research Center (ADRC). De diagnose AD wordt gedefinieerd als een significante cognitieve stoornis in de aanwezigheid van lage Aβ1-42 en verhoogde niveaus van totaal tau en p-tau in het hersenvocht [Mean Montreal Cognitive Assessment (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ELISA )]] (Tabel S1A). De controle (gemiddelde MoCA, 26,7 ± 2,2) had normale niveaus van CSF-biomarkers.
Humaan CSF wordt gekenmerkt door een dynamisch bereik van eiwit-abundantie, waarbij albumine en andere extreem overvloedige eiwitten de detectie van interessante eiwitten kunnen voorkomen (24). Om de diepte van de eiwitontdekking te vergroten, verwijderden we de eerste 14 zeer overvloedige eiwitten uit elk CSF-monster vóór massaspectrometrie (MS)-analyse (24). In totaal werden door MS 39.805 peptiden geïdentificeerd, die in 40 monsters werden toegewezen aan 3691 proteomen. Eiwitkwantificering wordt uitgevoerd door middel van meerdere tandem mass tag (TMT) labeling (18, 25). Om de ontbrekende gegevens op te lossen, hebben we alleen die eiwitten opgenomen die in ten minste 50% van de monsters in de daaropvolgende analyse waren gekwantificeerd, waardoor we uiteindelijk 2875 proteomen kwantificeerden. Vanwege het significante verschil in de totale eiwitabundantieniveaus werd een controlemonster statistisch gezien als een uitschieter beschouwd (13) en niet opgenomen in de daaropvolgende analyse. De waarden van de overvloed van de resterende 39 monsters werden aangepast op basis van leeftijd, geslacht en batchcovariantie (13-15, 17, 18, 20, 26).
Met behulp van statistische t-testanalyse om de differentiële expressie op de regressiegegevensset te evalueren, identificeerde deze analyse eiwitten waarvan de overvloedniveaus significant waren veranderd (P <0,05) tussen de controle- en AD-gevallen (Tabel S2A). Zoals weergegeven in Figuur 1A was de overvloed van in totaal 225 eiwitten in AD aanzienlijk verminderd, en was de overvloed van 303 eiwitten aanzienlijk toegenomen. Deze differentieel tot expressie gebrachte eiwitten omvatten verschillende eerder geïdentificeerde AD-markers voor hersenvocht, zoals microtubuli-geassocieerd eiwit tau (MAPT; P = 3,52 x 10−8), neurofilament (NEFL; P = 6,56 x 10−3), groeigerelateerd eiwit 43 (GAP43; P = 1,46 × 10−5), Vetzuurbindend Eiwit 3 (FABP3; P = 2,00 × 10−5), Chitinase 3 zoals 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10−6), Neuraal Granuline (NRGN; P = 3,43 × 10−4) en VGF zenuwgroeifactor (VGF; P = 4,83 × 10−3) (4-6). We hebben echter ook andere zeer belangrijke doelen geïdentificeerd, zoals GDP-dissociatieremmer 1 (GDI1; P = 1,54 x 10-10) en SPARC-gerelateerde modulaire calciumbinding 1 (SMOC1; P = 6,93 x 10-9). Gene Ontology (GO)-analyse van 225 significant gereduceerde eiwitten onthulde nauwe verbanden met lichaamsvloeistofprocessen zoals steroïdenmetabolisme, bloedstolling en hormoonactiviteit (Figuur 1B en Tabel S2B). Daarentegen is het aanzienlijk verhoogde eiwit van 303 nauw verwant aan de celstructuur en het energiemetabolisme.
(A) De vulkaanplot toont de log2-voudige verandering (x-as) ten opzichte van de -log10 statistische P-waarde (y-as) verkregen door de t-test, die wordt gebruikt om differentiële expressie tussen de controle (CT) en AD-gevallen van het CSF-proteoom Van alle eiwitten. Eiwitten met significant verlaagde niveaus (P <0,05) bij AD worden in blauw weergegeven, terwijl eiwitten met significant verhoogde niveaus bij ziekte in rood worden weergegeven. Het geselecteerde eiwit wordt gelabeld. (B) De belangrijkste GO-termen met betrekking tot eiwitten zijn aanzienlijk verminderd (blauw) en verhoogd (rood) in AD. Toont de drie GO-termen met de hoogste z-scores op het gebied van biologische processen, moleculaire functies en cellulaire componenten. (C) MS heeft het MAPT-niveau gemeten in het CSF-monster (links) en de correlatie ervan met het ELISA-tau-niveau van het monster (rechts). De Pearson-correlatiecoëfficiënt met de relevante P-waarde wordt weergegeven. Vanwege het ontbreken van ELISA-gegevens voor één AD-geval bevatten deze cijfers waarden voor 38 van de 39 geanalyseerde gevallen. (D) Onder toezicht staande clusteranalyse (P <0,0001, Benjamini-Hochberg (BH) aangepaste P <0,01) op de controle en AD CSF vond monsters met behulp van de 65 meest significant veranderde eiwitten in de dataset. Standaardiseren, normaliseren.
Het proteomische niveau van MAPT hangt nauw samen met het onafhankelijk gemeten ELISA-tau-niveau (r = 0,78, P = 7,8 × 10-9; Figuur 1C), wat de validiteit van onze MS-meting ondersteunt. Na trypsinedigestie op het niveau van amyloïde precursoreiwit (APP) kunnen de isovormspecifieke peptiden die zijn toegewezen aan de C-terminus van Aβ1-40 en Aβ1-42 niet efficiënt worden geïoniseerd (27, 28). Daarom hebben de APP-peptiden die we hebben geïdentificeerd niets te maken met ELISA Aβ1-42-niveaus. Om de differentiële expressie van elk geval te evalueren, gebruikten we differentieel tot expressie gebrachte eiwitten met P <0,0001 [valse ontdekkingssnelheid (FDR) gecorrigeerd P <0,01] om een gecontroleerde clusteranalyse van de monsters uit te voeren (Tabel S2A). Zoals weergegeven in Figuur 1D kunnen deze 65 zeer significante eiwitten monsters correct clusteren op basis van de ziektetoestand, met uitzondering van één AD-geval met controle-achtige kenmerken. Van deze 65 eiwitten namen er 63 toe in AD, terwijl slechts twee (CD74 en ISLR) afnamen. In totaal hebben deze hersenvochtanalyses honderden eiwitten in AD geïdentificeerd die kunnen dienen als biomarkers voor ziekten.
Vervolgens voerden we een onafhankelijke netwerkanalyse uit van het AD-hersenproteoom. Het hersencohort van deze ontdekking omvatte de dorsolaterale prefrontale cortex (DLPFC) van controlegevallen (n = 10), de ziekte van Parkinson (PD; n = 10), gemengde AD/PD (n = 10) en AD (n = 10) gevallen. ) Steekproef. Emery Goizueta ADRC. De demografische gegevens van deze 40 gevallen zijn eerder beschreven (25) en zijn samengevat in tabel S1B. We hebben TMT-MS gebruikt om deze 40 hersenweefsels en het replicatiecohort van 27 gevallen te analyseren. In totaal produceerden deze twee hersendatasets 227.121 unieke peptiden, die in kaart werden gebracht in 12.943 proteomen (25). Alleen die eiwitten die in ten minste 50% van de gevallen gekwantificeerd waren, werden in vervolgonderzoek meegenomen. De uiteindelijke ontdekkingsdataset bevat 8817 gekwantificeerde eiwitten. Pas de niveaus van eiwitovervloed aan op basis van leeftijd, geslacht en postmortem-interval (PMI). De differentiële expressieanalyse van de dataset na regressie toonde aan dat >2000 eiwitniveaus significant waren veranderd [P <0,05, variantieanalyse (ANOVA)] in twee of meer ziektecohorten. Vervolgens voerden we een gecontroleerde clusteranalyse uit op basis van de differentieel tot expressie gebrachte eiwitten, en P <0,0001 in AD/controle- en/of AD/PD-vergelijkingen (Figuur S2, A en B, Tabel S2C). Deze 165 sterk veranderde eiwitten geven duidelijk gevallen met AD-pathologie weer uit de controle- en PD-monsters, wat de sterke AD-specifieke veranderingen in het gehele proteoom bevestigt.
Vervolgens gebruikten we een algoritme genaamd Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA) om netwerkanalyse uit te voeren op het ontdekte hersenproteoom, dat de dataset organiseert in eiwitmodules met vergelijkbare expressiepatronen (11-13). De analyse identificeerde 44 modules (M) tot co-expressie gebrachte eiwitten, gesorteerd en genummerd van de grootste (M1, n = 1821 eiwitten) tot de kleinste (M44, n = 34 eiwitten) (Figuur 2A en Tabel S2D)). Zoals hierboven vermeld (13) Bereken het representatieve expressieprofiel of karakteristieke eiwit van elke module en correleer dit met de ziektetoestand en AD-pathologie, dat wil zeggen, breng de alliantie tot stand van Alzheimer's Disease Registry (CERAD) en Braak Score (Figuur 2B). In totaal waren 17 modules significant gerelateerd aan AD-neuropathologie (P <0,05). Veel van deze ziektegerelateerde modules zijn ook rijk aan celtypespecifieke markers (Figuur 2B). Zoals hierboven vermeld (13), wordt de verrijking van het celtype bepaald door de module-overlap en de referentielijst van celtype-specifieke genen te analyseren. Deze genen zijn afgeleid van gepubliceerde gegevens over geïsoleerde muisneuronen, endotheel- en gliacellen. Experiment voor RNA-sequencing (RNA-seq) (29).
(A) Ontdek de WGCNA van het hersenproteoom. (B) Biweight midcorrelatie (BiCor) analyse van het modulaire signatuureiwit (de eerste belangrijke component van modulaire eiwitexpressie) met neuropathologische kenmerken van AD (boven), inclusief CERAD (Aβ plaque) en Braak (tau tangles) scores. De intensiteiten van positieve (rode) en negatieve (blauwe) correlaties worden weergegeven door een tweekleurige hittekaart, en sterretjes geven statistische significantie aan (P <0,05). Gebruik Hypergeometrische Fisher's Exact Test (FET) (onder) om de celtypeassociatie van elke eiwitmodule te beoordelen. De intensiteit van de rode arcering geeft de mate van verrijking van het celtype aan, en het sterretje geeft statistische significantie aan (P <0,05). Gebruik de BH-methode om de P-waarde afgeleid van de FET te corrigeren. (C) GO-analyse van modulaire eiwitten. Voor elke module of gerelateerde modulegroep worden de meest verwante biologische processen weergegeven. oligo, oligodendrocyt.
Een set van vijf nauw verwante astrocyten- en microglia-rijke modules (M30, M29, M18, M24 en M5) vertoonden een sterke positieve correlatie met AD-neuropathie (Figuur 2B). Ontologieanalyse koppelt deze gliale modules aan celgroei, proliferatie en immuniteit (Figuur 2C en Tabel S2E). Twee extra gliale modules, M8 en M22, worden ook sterk opgereguleerd bij ziekte. M8 is sterk gerelateerd aan de Toll-achtige receptorroute, een signaalcascade die een sleutelrol speelt in de aangeboren immuunrespons (30). Tegelijkertijd is M22 nauw verwant aan post-translationele modificatie. M2, dat rijk is aan oligodendrocyten, vertoont een sterke positieve correlatie met AD-pathologie en een ontologisch verband met nucleosidesynthese en DNA-replicatie, wat wijst op verhoogde celproliferatie bij ziekten. Over het geheel genomen ondersteunen deze bevindingen de verhoging van gliale modules die we eerder hebben waargenomen in het AD-netwerkproteoom (13, 17). Momenteel is gebleken dat veel AD-gerelateerde gliale modules in het netwerk lagere expressieniveaus vertonen in controle- en PD-gevallen, wat hun ziektespecificiteit benadrukt die verhoogd is in AD (Figuur S2C).
Slechts vier modules in ons netwerkproteoom (M1, M3, M10 en M32) zijn sterk negatief gecorreleerd met AD-pathologie (P <0,05) (Figuur 2, B en C). Zowel M1 als M3 zijn rijk aan neuronale markers. M1 is sterk gerelateerd aan synaptische signalen, terwijl M3 nauw verwant is aan de mitochondriale functie. Er is geen bewijs van celtypeverrijking voor M10 en M32. M32 weerspiegelt het verband tussen M3 en het celmetabolisme, terwijl M10 sterk gerelateerd is aan celgroei en microtubulifunctie. Vergeleken met AD zijn alle vier de modules verbeterd in controle en PD, waardoor ze ziektespecifieke AD-veranderingen krijgen (Figuur S2C). Over het geheel genomen ondersteunen deze resultaten de verminderde overvloed aan neuronrijke modules die we eerder in AD hebben waargenomen (13, 17). Samenvattend produceerde de netwerkanalyse van het hersenproteoom die we ontdekten AD-specifiek gewijzigde modules, consistent met onze eerdere bevindingen.
AD wordt gekenmerkt door een vroeg asymptomatisch stadium (AsymAD), waarin individuen amyloïdeaccumulatie vertonen zonder klinische cognitieve achteruitgang (5, 31). Deze asymptomatische fase vertegenwoordigt een cruciaal venster voor vroege detectie en interventie. We hebben eerder een sterke modulaire conservering van het AsymAD- en AD-hersennetwerkproteoom aangetoond in onafhankelijke datasets (13, 17). Om ervoor te zorgen dat het hersennetwerk dat we momenteel hebben ontdekt consistent is met deze eerdere bevindingen, hebben we het behoud van 44 modules in de gerepliceerde dataset van 27 DLPFC-organisaties geanalyseerd. Deze organisaties omvatten controle- (n = 10), AsymAD- (n = 8) en AD-gevallen (n = 9). Controle- en AD-monsters werden opgenomen in de analyse van ons ontdekkingshersencohort (Tabel S1B), terwijl AsymAD-gevallen alleen uniek waren in het replicatiecohort. Deze AsymAD-gevallen kwamen ook uit de Emory Goizueta ADRC-hersenbank. Hoewel de cognitie normaal was op het moment van overlijden, waren de amyloïdespiegels abnormaal hoog (gemiddelde CERAD, 2,8 ± 0,5) (Tabel S1B).
TMT-MS-analyse van deze 27 hersenweefsels resulteerde in de kwantificering van 11.244 proteomen. Deze definitieve telling omvat alleen de eiwitten die in ten minste 50% van de monsters zijn gekwantificeerd. Deze gerepliceerde dataset bevat 8638 (98,0%) van de 8817 eiwitten die zijn gedetecteerd in onze hersenanalyse, en bevat bijna 3000 significant veranderde eiwitten tussen de controle- en AD-cohorten (P <0,05, na Tukey's gepaarde t-test voor variantieanalyse) ( Tabel S2F). Van deze differentieel tot expressie gebrachte eiwitten vertoonden 910 ook significante niveauveranderingen tussen AD en hersenproteoomcontrolegevallen (P <0,05, na ANOVA Tukey gepaarde t-test). Het is vermeldenswaard dat deze 910-markers zeer consistent zijn in de richting van verandering tussen proteomen (r = 0,94, P <1,0 x 10-200) (Figuur S3A). Van de toegenomen eiwitten zijn de eiwitten met de meest consistente veranderingen tussen datasets voornamelijk leden van de gliale rijke M5- en M18-modules (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 en GFAP). Van de gereduceerde eiwitten waren degenen met de meest consistente veranderingen bijna uitsluitend leden van de M1-module (NPTX2, VGF en RPH3A) geassocieerd met de synaps. We hebben de AD-gerelateerde veranderingen van midkine (MDK), CD44, uitgescheiden frizzled-gerelateerd eiwit 1 (SFRP1) en VGF verder geverifieerd door western blotting (Figuur S3B). Analyse van modulebehoud toonde aan dat ongeveer 80% van de eiwitmodules (34/44) in het hersenproteoom significant geconserveerd waren in de replicatiegegevensset (z-score> 1,96, FDR gecorrigeerde P <0,05) (Figuur S3C). Veertien van deze modules waren speciaal gereserveerd tussen de twee proteomen (z-score> 10, FDR gecorrigeerde P <1,0 x 10−23). Over het geheel genomen benadrukt de ontdekking en replicatie van de hoge mate van consistentie in differentiële expressie en modulaire samenstelling tussen het hersenproteoom de reproduceerbaarheid van de veranderingen in AD frontale cortexeiwitten. Bovendien bevestigde het ook dat AsymAD en meer gevorderde ziekten een zeer vergelijkbare hersennetwerkstructuur hebben.
Een meer gedetailleerde analyse van de differentiële expressie in de hersenreplicatiegegevensset benadrukt de significante mate van AsymAD-eiwitveranderingen, waaronder een totaal van 151 significant veranderde eiwitten tussen AsymAD en de controle (P <0,05) (Figuur S3D). In overeenstemming met de amyloïdbelasting nam de APP in de hersenen van AsymAD en AD aanzienlijk toe. MAPT verandert alleen significant bij AD, wat consistent is met verhoogde niveaus van tangles en de bekende correlatie met cognitieve achteruitgang (5, 7). De gliale-rijke modules (M5 en M18) worden sterk weerspiegeld in de verhoogde eiwitten in AsymAD, terwijl de neurongerelateerde M1-module de meest representatieve is van de verminderde eiwitten in AsymAD. Veel van deze AsymAD-markers laten grotere veranderingen zien bij symptomatische ziekten. Een van deze markers is SMOC1, een gliale proteïne behorend tot M18, die geassocieerd is met hersentumoren en de ontwikkeling van ogen en ledematen (32). MDK is een heparinebindende groeifactor die verband houdt met celgroei en angiogenese (33), een ander lid van M18. Vergeleken met de controlegroep nam AsymAD significant toe, gevolgd door een grotere toename van AD. Daarentegen was het synaptische eiwit neuropentraxine 2 (NPTX2) significant verminderd in de AsymAD-hersenen. NPTX2 werd eerder geassocieerd met neurodegeneratie en speelt een erkende rol bij het mediëren van excitatoire synapsen (34). Over het geheel genomen onthullen deze resultaten een verscheidenheid aan verschillende preklinische eiwitveranderingen bij AD, die lijken te evolueren met de ernst van de ziekte.
Gegeven dat we een aanzienlijke diepte van eiwitdekking hebben bereikt bij de ontdekking van het hersenproteoom, proberen we de overlap ervan met het AD-transcriptoom op netwerkniveau beter te begrijpen. Daarom vergeleken we het hersenproteoom dat we ontdekten met de module die we eerder genereerden op basis van de microarray-meting van 18.204 genen in AD (n = 308) en controle (n = 157) DLPFC-weefsels (13). overlappend. In totaal hebben we 20 verschillende RNA-modules geïdentificeerd, waarvan er vele de verrijking van specifieke celtypen hebben aangetoond, waaronder neuronen, oligodendrocyten, astrocyten en microglia (Figuur 3A). De meerdere wijzigingen van deze modules in AD worden weergegeven in figuur 3B. In overeenstemming met onze eerdere eiwit-RNA-overlappingsanalyse met behulp van het diepere ongelabelde MS-proteoom (ongeveer 3000 eiwitten) (13), bevinden de meeste van de 44 modules in het hersenproteoomnetwerk die we hebben gevonden zich in het transcriptoomnetwerk. Er is geen significante overlap in. onze ontdekking en replicatie van de 34 eiwitmodules die in hoge mate worden vastgehouden in het hersenproteoom, slechts 14 (~ 40%) slaagden voor de Fisher's exact test (FET) en bleken een statistisch significante overlap te hebben met het transcriptoom (Figuur 3A). Compatibel met DNA-schadeherstel (P-M25 en P-M19), eiwittranslatie (P-M7 en P-M20), RNA-binding/-splitsing (P-M16 en P-M21) en eiwittargeting (P-M13 en P-M21) M23) overlapt niet met modules in het transcriptoom. Daarom, hoewel een diepere proteoomgegevensset wordt gebruikt in de huidige overlapanalyse (13), wordt het grootste deel van het AD-netwerkproteoom niet toegewezen aan het transcriptoomnetwerk.
(A) Hypergeometrische FET demonstreert de verrijking van celtype-specifieke markers in de RNA-module van het AD-transcriptoom (boven) en de mate van overlap tussen de RNA- (x-as) en eiwit- (y-as) modules van de AD-hersenen (onderkant) . De intensiteit van de rode arcering geeft de mate van verrijking van celtypen in het bovenste paneel aan en de intensiteit van de overlap van de modules in het onderste paneel. Sterretjes geven statistische significantie aan (P <0,05). (B) De mate van correlatie tussen de karakteristieke genen van elke transcriptoommodule en de AD-status. De modules aan de linkerkant zijn het meest negatief gecorreleerd met AD (blauw), en die aan de rechterkant zijn het meest positief gecorreleerd met AD (rood). De log-getransformeerde BH-gecorrigeerde P-waarde geeft de mate van statistische significantie van elke correlatie aan. (C) Aanzienlijke overlappende modules met gedeelde celtypeverrijking. (D) Correlatieanalyse van de log2-voudige verandering van het gelabelde eiwit (x-as) en RNA (y-as) in de overlappende module. De Pearson-correlatiecoëfficiënt met de relevante P-waarde wordt weergegeven. Micro, microglia; hemellichamen, astrocyten. CT, controle.
De meeste overlappende eiwit- en RNA-modules delen vergelijkbare celtypeverrijkingsprofielen en consistente AD-veranderingsrichtingen (Figuur 3, B en C). Met andere woorden, de synapsgerelateerde M1-module van het hersenproteoom (PM 1) wordt toegewezen aan drie neuronale rijke homologe RNA-modules (R-M1, R-M9 en R-M16), die zich in AD bevinden. een verlaagd niveau. Op dezelfde manier overlappen de gliale-rijke M5- en M18-eiwitmodules met RNA-modules die rijk zijn aan astrocyten en microgliale markers (R-M3, R-M7 en R-M10) en zijn ze sterk betrokken bij de toename van ziekten. Deze gedeelde modulaire kenmerken tussen de twee datasets ondersteunen verder de verrijking van het celtype en de ziektegerelateerde veranderingen die we hebben waargenomen in het hersenproteoom. We hebben echter veel significante verschillen waargenomen tussen de RNA- en eiwitniveaus van individuele markers in deze gedeelde modules. Correlatieanalyse van de differentiële expressie van de proteomics en transcriptomics van de moleculen binnen deze overlappende modules (Figuur 3D) benadrukt deze inconsistentie. APP en verschillende andere gliale module-eiwitten (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 en SFRP1) vertoonden bijvoorbeeld een significante toename in het AD-proteoom, maar er was vrijwel geen verandering in het AD-transcriptoom. Deze eiwitspecifieke veranderingen kunnen nauw verwant zijn aan amyloïde plaques (23, 35), waarbij het proteoom wordt benadrukt als de bron van pathologische veranderingen, en deze veranderingen worden mogelijk niet weerspiegeld in het transcriptoom.
Na een onafhankelijke analyse van de proteomen van de hersenen en het hersenvocht die we ontdekten, voerden we een uitgebreide analyse uit van de twee datasets om AD CSF-biomarkers te identificeren die verband houden met de pathofysiologie van het hersennetwerk. We moeten eerst de overlap van de twee proteomen definiëren. Hoewel het algemeen wordt aanvaard dat CSF neurochemische veranderingen in de AD-hersenen weerspiegelt (4), is de exacte mate van overlap tussen de AD-hersenen en het CSV-proteoom onduidelijk. Door het aantal gedeelde genproducten te vergelijken dat in onze twee proteomen werd gedetecteerd, ontdekten we dat bijna 70% (n = 1936) van de eiwitten die in het hersenvocht werden geïdentificeerd, ook in de hersenen werden gekwantificeerd (Figuur 4A). De meeste van deze overlappende eiwitten (n = 1721) worden toegewezen aan een van de 44 co-expressiemodules uit de dataset van de ontdekkingshersenen (Figuur 4B). Zoals verwacht vertoonden de zes grootste hersenmodules (M1 tot M6) de grootste hoeveelheid hersenvochtoverlap. Er zijn echter kleinere hersenmodules (bijvoorbeeld M15 en M29) die een onverwacht hoge mate van overlap bereiken, groter dan een hersenmodule die twee keer zo groot is. Dit motiveert ons om een meer gedetailleerde, statistisch gestuurde methode toe te passen om de overlap tussen de hersenen en het hersenvocht te berekenen.
(A en B) De eiwitten die worden gedetecteerd in de datasets van de ontdekkingshersenen en CSF overlappen elkaar. De meeste van deze overlappende eiwitten zijn geassocieerd met een van de 44 co-expressiemodules van het co-expressienetwerk in de hersenen. (C) Ontdek de overlap tussen het proteoom van het hersenvocht en het proteoom van het hersennetwerk. Elke rij van de hittekaart vertegenwoordigt een afzonderlijke overlapanalyse van de hypergeometrische FET. De bovenste rij toont de overlap (grijs/zwarte arcering) tussen de hersenmodule en het gehele CSF-proteoom. De tweede regel laat zien dat de overlap tussen hersenmodules en CSF-eiwit (rood gearceerd) aanzienlijk wordt verhoogd bij AD (P <0,05). De derde rij laat zien dat de overlap tussen hersenmodules en CSF-eiwit (blauwe arcering) aanzienlijk naar beneden wordt gereguleerd bij AD (P <0,05). Gebruik de BH-methode om de P-waarde afgeleid van de FET te corrigeren. (D) Opvouwbaar modulepaneel op basis van celtypeassociatie en gerelateerde GO-termen. Deze panels bevatten in totaal 271 hersengerelateerde eiwitten, die een betekenisvolle differentiële expressie hebben in het CSF-proteoom.
Met behulp van enkelzijdige FET's hebben we het belang van eiwitoverlapping tussen het CSF-proteoom en individuele hersenmodules beoordeeld. Uit de analyse bleek dat in totaal 14 hersenmodules in de CSF-gegevensset statistisch significante overlappingen hebben (FDR-aangepaste P <0,05), en een extra module (M18) waarvan de overlap bijna significant is (FDR-aangepaste P = 0,06) (Figuur 4C , bovenste rij). We zijn ook geïnteresseerd in modules die sterk overlappen met differentieel tot expressie gebrachte CSF-eiwitten. Daarom hebben we twee aanvullende FET-analyses toegepast om te bepalen welke van (i) CSF-eiwit significant was verhoogd bij AD en (ii) CSF-eiwit significant was verlaagd bij AD (P <0,05, gepaarde t-test AD/controle). Hersenmodules met betekenisvolle overlap tussen hen. Zoals weergegeven in de middelste en onderste rijen van figuur 4C laten deze aanvullende analyses zien dat 8 van de 44 hersenmodules aanzienlijk overlappen met het eiwit dat is toegevoegd in AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 en M38). . ), terwijl slechts twee modules (M6 en M15) een betekenisvolle overlap vertoonden met het gereduceerde eiwit in AD CSF. Zoals verwacht bevinden alle 10 modules zich in de 15 modules met de hoogste overlap met het CSF-proteoom. Daarom gaan we ervan uit dat deze 15 modules bronnen met hoge opbrengst zijn van uit AD-hersenen afkomstige CSF-biomarkers.
We hebben deze 15 overlappende modules in vijf grote eiwitpanelen gevouwen op basis van hun nabijheid in het WGCNA-boomdiagram en hun associatie met celtypen en genontologie (Figuur 4D). Het eerste paneel bevat modules die rijk zijn aan neuronmarkers en synapsgerelateerde eiwitten (M1 en M12). Het synaptische panel bevat in totaal 94 eiwitten en de niveaus in het CSF-proteoom zijn aanzienlijk veranderd, waardoor het de grootste bron van hersengerelateerde CSF-markers van de vijf panels is. De tweede groep (M6 en M15) toonde het nauwe verband aan met endotheelcelmarkers en vasculaire lichamen, zoals ‘wondgenezing’ (M6) en ‘regulatie van de humorale immuunrespons’ (M15). M15 is ook sterk gerelateerd aan het lipoproteïnemetabolisme, dat nauw verwant is aan het endotheel (36). Het vasculaire paneel bevat 34 CSF-markers die verband houden met de hersenen. De derde groep omvat modules (M2 en M4) die significant gerelateerd zijn aan oligodendrocytmarkers en celproliferatie. De ontologietermen van M2 op het hoogste niveau omvatten bijvoorbeeld ‘positieve regulatie van DNA-replicatie’ en ‘purinebiosyntheseproces’. Ondertussen omvatten die van M4 “gliale celdifferentiatie” en “chromosoomsegregatie”. Het myelinisatiepaneel bevat 49 CSF-markers die verband houden met de hersenen.
De vierde groep bevat de meeste modules (M30, M29, M18, M24 en M5), en bijna alle modules zijn aanzienlijk rijk aan microglia- en astrocytenmarkers. Net als het myelinisatiepaneel bevat het vierde paneel ook modules (M30, M29 en M18) die nauw verwant zijn aan celproliferatie. De andere modules in deze groep zijn sterk gerelateerd aan immunologische termen, zoals ‘immuuneffectproces’ (M5) en ‘immuunresponsregulatie’ (M24). De gliale immuungroep bevat 42 CSF-markers die verband houden met de hersenen. Ten slotte bevat het laatste paneel 52 hersengerelateerde markers op de vier modules (M44, M3, M33 en M38), die allemaal op het lichaam betrekking hebben op energieopslag en metabolisme. De grootste van deze modules (M3) is nauw verwant aan de mitochondriën en is rijk aan neuronspecifieke markers. M38 is een van de kleinere moduleleden in dit metaboloom en vertoont ook een matige neuronspecificiteit.
Over het geheel genomen weerspiegelen deze vijf panelen een breed scala aan celtypen en functies in de AD-cortex, en bevatten ze gezamenlijk 271 hersengerelateerde CSF-markers (Tabel S2G). Om de geldigheid van deze MS-resultaten te evalueren, hebben we de proximity extension assay (PEA) gebruikt, een orthogonale antilichaamgebaseerde technologie met multiplexmogelijkheden, hoge gevoeligheid en specificiteit, en hebben we de hersenvochtmonsters die we vonden opnieuw geanalyseerd. Een subset van deze 271 biomarkers (n = 36). Deze 36 doelen demonstreren de verandering in het AD-veelvoud van PEA, die nauw verwant is aan onze op MS gebaseerde bevindingen (r = 0,87, P = 5,6 × 10-12), wat de resultaten van onze uitgebreide MS-analyse sterk verifieerde (Figuur S4 ).
De biologische thema's die door onze vijf groepen worden benadrukt, van synaptische signalering tot energiemetabolisme, houden allemaal verband met de pathogenese van AD (1-3). Daarom zijn alle 15 modules die deze panelen bevatten gerelateerd aan de AD-pathologie in het hersenproteoom dat we ontdekten (Figuur 2B). Het meest opvallende is de hoge positieve pathologische correlatie tussen onze gliale modules en de sterke negatieve pathologische correlatie tussen onze grootste neuronale modules (M1 en M3). De differentiële expressieanalyse van ons gerepliceerde hersenproteoom (Figuur S3D) benadrukt ook van M5 en M18 afgeleide gliale eiwitten. Bij AsymAD en symptomatische AD zijn de gliale eiwitten en M1-gerelateerde synapsen het meest toegenomen. Het eiwit is het meest verminderd. Deze waarnemingen geven aan dat de 271 hersenvochtmarkers die we in de vijf groepen hebben geïdentificeerd, verband houden met ziekteprocessen in de AD-cortex, inclusief die welke plaatsvinden in de vroege asymptomatische stadia.
Om de veranderingsrichting van de paneleiwitten in het hersen- en ruggenmergvocht beter te kunnen analyseren, hebben we voor elk van de 15 overlappende modules het volgende getekend: (i) vonden het niveau van de module-abundantie in de hersendataset en (ii) de module eiwit Het verschil komt tot uiting in het hersenvocht (Figuur S5). Zoals eerder vermeld, wordt WGCNA gebruikt om de overvloed aan modules of de karakteristieke eiwitwaarde in de hersenen te bepalen (13). De vulkaankaart wordt gebruikt om de differentiële expressie van modulaire eiwitten in het hersenvocht (AD/controle) te beschrijven. Deze figuren laten zien dat drie van de vijf panelen verschillende expressietrends in het hersen- en ruggenmergvocht laten zien. De twee modules van het synapspaneel (M1 en M12) vertonen een afname van het overvloedsniveau in de AD-hersenen, maar overlappen aanzienlijk met het verhoogde eiwit in het AD CSF (Figuur S5A). De neurongerelateerde modules die het metaboloom bevatten (M3 en M38) vertoonden vergelijkbare inconsistente expressiepatronen in de hersenen en het hersenvocht (Figuur S5E). Het vasculaire panel vertoonde ook verschillende expressietrends, hoewel de modules (M6 en M15) matig verhoogd waren in de AD-hersenen en afnamen in het zieke hersenvocht (Figuur S5B). De overige twee panelen bevatten grote gliale netwerken waarvan de eiwitten in beide compartimenten consistent worden opgereguleerd (Figuur S5, C en D).
Houd er rekening mee dat deze trends niet voor alle markers in deze panelen gelden. Het synaptische paneel bevat bijvoorbeeld verschillende eiwitten die aanzienlijk zijn verminderd in de AD-hersenen en CSF (Figuur S5A). Tot deze naar beneden gereguleerde markers voor hersenvocht behoren NPTX2 en VGF van M1, en chromogranine B van M12. Ondanks deze uitzonderingen zijn de meeste van onze synaptische markers echter verhoogd in het ruggenmergvocht bij AD. Over het geheel genomen konden deze analyses in elk van onze vijf panels statistisch significante trends in de niveaus van hersen- en hersenvocht onderscheiden. Deze trends benadrukken de complexe en vaak verschillende relatie tussen hersen- en CSF-eiwitexpressie bij AD.
Vervolgens hebben we MS-replicatieanalyse met hoge doorvoer (CSF-replicatie 1) gebruikt om onze 271 set biomarkers te beperken tot de meest veelbelovende en reproduceerbare doelen (Figuur 5A). CSF-kopie 1 bevat in totaal 96 monsters van Emory Goizueta ADRC, inclusief controle-, AsymAD- en AD-cohort (tabel S1A). Deze AD-gevallen worden gekenmerkt door milde cognitieve achteruitgang (gemiddelde MoCA, 20,0 ± 3,8) en veranderingen in AD-biomarkers bevestigd in hersenvocht (Tabel S1A). In tegenstelling tot de CSF-analyse die we hebben gevonden, wordt deze replicatie uitgevoerd met behulp van een efficiëntere en high-throughput ‘single-shot’ MS-methode (zonder offline fractionering), inclusief een vereenvoudigd monstervoorbereidingsprotocol dat de noodzaak voor immunodepletie van individuele monsters elimineert. . In plaats daarvan wordt een enkel immuunverarmd “verbeteringskanaal” gebruikt om het signaal van minder overvloedige eiwitten te versterken (37). Hoewel het de totale proteoomdekking vermindert, vermindert deze single-shot-methode de machinetijd aanzienlijk en verhoogt het aantal TMT-gelabelde monsters dat levensvatbaar kan worden geanalyseerd (17, 38). In totaal identificeerde de analyse 6.487 peptiden, die in 96 gevallen werden toegewezen aan 1.183 proteomen. Net als bij de CSV-analyse die we vonden, werden alleen de eiwitten die in ten minste 50% van de monsters waren gekwantificeerd, meegenomen in de daaropvolgende berekeningen, en werden de gegevens geregressief voor de effecten van leeftijd en geslacht. Dit leidde tot de uiteindelijke kwantificering van 792 proteomen, waarvan 95% ook werd geïdentificeerd in de gevonden CSF-dataset.
(A) Hersengerelateerde CSF-eiwitdoelen geverifieerd in het eerste gerepliceerde CSF-cohort en opgenomen in het laatste panel (n = 60). (B tot E) Panelbiomarkerniveaus (samengestelde z-scores) gemeten in de vier CSF-replicatiecohorten. Gepaarde t-tests of ANOVA met Tukey's post-correctie werden gebruikt om de statistische significantie van de veranderingen in overvloed in elke replicaatanalyse te evalueren. CT, controle.
Omdat we vooral geïnteresseerd zijn in het verifiëren van onze 271 hersengerelateerde CSF-doelen door middel van uitgebreide analyse, zullen we het verdere onderzoek van dit gerepliceerde proteoom beperken tot deze markers. Van deze 271 eiwitten werden er 100 gedetecteerd in CSF-replicatie 1. Figuur S6A toont de differentiële expressie van deze 100 overlappende markers tussen de controle- en AD-replicatiemonsters. Synaptische en metaboliethistonen nemen het meest toe bij AD, terwijl vasculaire eiwitten het meest afnemen bij ziekte. De meeste van de 100 overlappende markeringen (n = 70) behielden dezelfde richting van verandering in de twee datasets (Figuur S6B). Deze 70 gevalideerde hersengerelateerde CSF-markers (Tabel S2H) weerspiegelen grotendeels de eerder waargenomen panelexpressietrends, dat wil zeggen de neerwaartse regulatie van vasculaire eiwitten en de opwaartse regulatie van alle andere panels. Slechts 10 van deze 70 gevalideerde eiwitten vertoonden veranderingen in de AD-abundantie die in tegenspraak waren met deze paneltrends. Om een panel te genereren dat de algemene trend van de hersenen en het hersenvocht het beste weerspiegelt, hebben we deze 10 eiwitten uitgesloten van het interessante panel dat we uiteindelijk hebben geverifieerd (Figuur 5A). Daarom omvat ons panel uiteindelijk in totaal 60 eiwitten die zijn geverifieerd in twee onafhankelijke CSF AD-cohorten met behulp van verschillende monstervoorbereiding en MS-platformanalyse. De z-score-expressiegrafieken van deze laatste panelen in de CSF-kopie 1-controle en AD-gevallen bevestigden de paneltrend die werd waargenomen in het CSF-cohort dat we vonden (Figuur 5B).
Onder deze 60 eiwitten bevinden zich moleculen waarvan bekend is dat ze geassocieerd zijn met AD, zoals osteopontine (SPP1), een pro-inflammatoir cytokine dat in veel onderzoeken in verband is gebracht met AD (39-41), en GAP43, een synaptisch eiwit. dat houdt duidelijk verband met neurodegeneratie (42). De meest volledig geverifieerde eiwitten zijn markers die verband houden met andere neurodegeneratieve ziekten, zoals aan amyotrofische laterale sclerose (ALS) gerelateerde superoxide dismutase 1 (SOD1) en aan de ziekte van Parkinson gerelateerde desaccharase (PARK7). We hebben ook geverifieerd dat veel andere markers, zoals SMOC1 en hersenrijke membraanbevestigingssignaleringseiwit 1 (BASP1), eerdere verbanden met neurodegeneratie hebben beperkt. Het is de moeite waard om op te merken dat het vanwege hun lage algehele overvloed in het CSF-proteoom moeilijk voor ons is om deze single-shot detectiemethode met hoge doorvoer te gebruiken om op betrouwbare wijze MAPT en bepaalde andere AD-gerelateerde eiwitten (bijvoorbeeld NEFL en NRGN) te detecteren. ) (43, 44).
Vervolgens hebben we deze 60 prioriteitspaneelmarkeringen gecontroleerd in drie aanvullende replicaatanalyses. In CSF Copy 2 gebruikten we een enkele TMT-MS om een onafhankelijk cohort van 297 controle- en AD-monsters van Emory Goizueta ADRC te analyseren (17). CSF-replicatie 3 omvatte een heranalyse van beschikbare TMT-MS-gegevens van 120 controle- en AD-patiënten uit Lausanne, Zwitserland (45). We hebben meer dan tweederde van de 60 prioriteitsmarkeringen in elke dataset gedetecteerd. Hoewel in het Zwitserse onderzoek gebruik werd gemaakt van verschillende MS-platforms en TMT-kwantificatiemethoden (45, 46), reproduceerden we onze paneltrends sterk in twee herhaalde analyses (Figuur 5, C en D, en Tabellen S2, I en J). Om de ziektespecificiteit van onze groep te evalueren, gebruikten we TMT-MS om de vierde replicatiegegevensset (CSF-replicatie 4) te analyseren, die niet alleen controle- (n = 18) en AD (n = 17) gevallen omvatte, maar ook PD ( n = 14)), ALS (n = 18) en frontotemporale dementie (FTD) monsters (n = 11) (Tabel S1A). We hebben met succes bijna tweederde van de paneleiwitten in dit cohort gekwantificeerd (38 van de 60). Deze resultaten benadrukken de AD-specifieke veranderingen in alle vijf biomarkerpanelen (Figuur 5E en Tabel S2K). De toename in de metabolietgroep vertoonde de sterkste AD-specificiteit, gevolgd door de myelinisatie- en gliale groep. In mindere mate vertoont FTD ook een stijging tussen deze panels, wat een weerspiegeling kan zijn van soortgelijke potentiële netwerkveranderingen (17). ALS en PD vertoonden daarentegen vrijwel dezelfde myelinisatie-, gliale en metaboloomprofielen als de controlegroep. Ondanks verschillen in monstervoorbereiding, MS-platform en TMT-kwantificeringsmethoden laten deze herhaalde analyses over het geheel genomen zien dat onze prioriteitspanelmarkers zeer consistente AD-specifieke veranderingen vertonen in meer dan 500 unieke CSF-monsters.
Neurodegeneratie bij AD wordt al enkele jaren vóór het begin van cognitieve symptomen algemeen erkend, dus er is een dringende behoefte aan biomarkers voor AsymAD (5, 31). Uit steeds meer bewijzen blijkt echter dat de biologie van AsymAD verre van homogeen is, en dat de complexe interactie tussen risico en veerkracht leidt tot grote individuele verschillen in de daaropvolgende ziekteprogressie (47). Hoewel ze worden gebruikt om AsymAD-gevallen te identificeren, is het niet bewezen dat de niveaus van de kernbiomarkers van het hersenvocht (Aβ1-42, totaal tau en p-tau) op betrouwbare wijze kunnen voorspellen wie zal evolueren naar dementie (4, 7). Het is noodzakelijk om holistische biomarkerinstrumenten op te nemen die zijn gebaseerd op meerdere aspecten van de hersenfysiologie om het risico van deze populatie nauwkeurig te stratificeren. Daarom analyseerden we vervolgens ons AD-gevalideerde biomarkerpanel in de AsymAD-populatie van CSF-kopie 1. Deze 31 AsymAD-gevallen vertoonden abnormale kernbiomarkerniveaus (Aβ1–42/totale tau ELISA-ratio, <5,5) en volledige cognitie (gemiddelde MoCA, 27,1). ± 2,2) (Tabel S1A). Bovendien hebben alle personen met AsymAD een klinische dementiescore van 0, wat aangeeft dat er geen bewijs is van een achteruitgang in de dagelijkse cognitieve of functionele prestaties.
We analyseerden eerst de niveaus van de gevalideerde panels in alle 96 CSF-replica's 1, inclusief het AsymAD-cohort. We ontdekten dat verschillende panels in de AsymAD-groep significante AD-achtige veranderingen in de overvloed vertoonden, het vasculaire panel vertoonde een neerwaartse trend in AsymAD, terwijl alle andere panels een opwaartse trend vertoonden (Figuur 6A). Daarom vertoonden alle panels een zeer significante correlatie met ELISA Aβ1-42 en totale tau-niveaus (Figuur 6B). Daarentegen is de correlatie tussen de groep en de MoCA-score relatief slecht. Een van de meest opvallende bevindingen uit deze analyses is het grote bereik aan panelabundanties in het AsymAD-cohort. Zoals weergegeven in figuur 6A overschrijdt het panelniveau van de AsymAD-groep gewoonlijk het panelniveau van de controlegroep en de AD-groep, wat een relatief hoge variabiliteit vertoont. Om deze heterogeniteit van AsymAD verder te onderzoeken, hebben we Multidimensional Scaling (MDS)-analyse toegepast op 96 CSF-replicatiegevallen. MDS-analyse maakt het mogelijk om de gelijkenis tussen gevallen te visualiseren op basis van bepaalde variabelen in de dataset. Voor deze clusteranalyse gebruiken we alleen die gevalideerde panelmarkers die een statistisch significante verandering (P <0,05, AD/controle) hebben in het CSF-detectie- en replicatie-1-proteoom (n = 29) (Tabel S2L) niveau. Deze analyse leverde een duidelijke ruimtelijke clustering op tussen onze controle- en AD-gevallen (Figuur 6C). Daarentegen zijn sommige AsymAD-gevallen duidelijk geclusterd in de controlegroep, terwijl andere zich in AD-gevallen bevinden. Om deze AsymAD-heterogeniteit verder te onderzoeken, hebben we onze MDS-kaart gebruikt om twee groepen van deze AsymAD-gevallen te definiëren. De eerste groep omvatte AsymAD-gevallen die dichter bij de controle waren geclusterd (n = 19), terwijl de tweede groep werd gekenmerkt door AsymAD-gevallen met een markerprofiel dichter bij AD (n = 12).
(A) Het expressieniveau (z-score) van de CSF-biomarkergroep in alle 96 monsters in het CSF-replicatie 1-cohort, inclusief AsymAD. Variantieanalyse met de post-correctie van Tukey werd gebruikt om de statistische significantie van veranderingen in de panelabundantie te evalueren. (B) Correlatieanalyse van paneleiwitabundantieniveau (z-score) met MoCA-score en totaal tau-niveau in ELISA Aβ1-42 en CSF kopie 1-monsters. De Pearson-correlatiecoëfficiënt met de relevante P-waarde wordt weergegeven. (C) De MDS van 96 CSF-kopie 1-gevallen was gebaseerd op de overvloedniveaus van 29 gevalideerde panelmarkers, die significant waren veranderd in zowel de ontdekkings- als de CSF-kopie 1-gegevenssets [P <0,05 AD/controle (CT)]. Deze analyse werd gebruikt om de AsymAD-groep te verdelen in controle- (n = 19) en AD- (n = 12) subgroepen. (D) De vulkaanplot toont de differentiële expressie van alle CSF-replicatie 1-eiwitten met log2-voudige verandering (x-as) ten opzichte van de -log10 statistische P-waarde tussen de twee AsymAD-subgroepen. De panelbiomarkers zijn gekleurd. (E) CSF-replicatie 1-abundantieniveau van de biomarkers van de selectiegroep worden differentieel tot expressie gebracht tussen AsymAD-subgroepen. De achteraf gecorrigeerde variantieanalyse van Tukey werd gebruikt om de statistische significantie te beoordelen.
We onderzochten de differentiële eiwitexpressie tussen deze controle- en AD-achtige AsymAD-gevallen (Figuur 6D en Tabel S2L). De resulterende vulkaankaart laat zien dat 14 paneelmarkeringen aanzienlijk zijn veranderd tussen de twee groepen. De meeste van deze markers zijn leden van de synaps en het metaboloom. SOD1 en gemyristoyleerd alaninerijk proteïnekinase C-substraat (MARCKS), die respectievelijk lid zijn van de myeline- en gliale immuungroepen, behoren echter ook tot deze groep (Figuur 6, D en E). Het vasculaire panel droeg ook twee markers bij die significant waren verminderd in de AD-achtige AsymAD-groep, waaronder AE-bindend eiwit 1 (AEBP1) en complementfamilielid C9. Er was geen significant verschil tussen de controle- en AD-achtige AsymAD-subgroepen in ELISA AB1-42 (P = 0,38) en p-tau (P = 0,28), maar er was inderdaad een significant verschil in het totale tau-niveau (P = 0,0031). ) (Afb. S7). Er zijn verschillende panelmarkeringen die aangeven dat de veranderingen tussen de twee AsymAD-subgroepen belangrijker zijn dan de totale tau-niveaus (bijvoorbeeld YWHAZ, SOD1 en MDH1) (Figuur 6E). Over het geheel genomen geven deze resultaten aan dat ons gevalideerde panel biomarkers kan bevatten die subtypering en potentiële risicostratificatie van patiënten met asymptomatische ziekte kunnen veroorzaken.
Er is een dringende behoefte aan systeemgebaseerde biomarkerhulpmiddelen om de verschillende pathofysiologie achter AD beter te meten en te targeten. Verwacht wordt dat deze hulpmiddelen niet alleen ons diagnostisch raamwerk voor AD zullen veranderen, maar ook de adoptie van effectieve, patiëntspecifieke behandelstrategieën zullen bevorderen (1, 2). Daartoe hebben we een onbevooroordeelde alomvattende proteomics-benadering toegepast op AD-hersenen en CSF om webgebaseerde CSF-biomarkers te identificeren die een breed scala aan op de hersenen gebaseerde pathofysiologie weerspiegelen. Onze analyse leverde vijf CSF-biomarkerpanels op, die (i) synapsen, bloedvaten, myeline, immuun- en metabolische disfunctie weerspiegelen; (ii) sterke reproduceerbaarheid aantonen op verschillende MS-platforms; (iii) Progressieve ziektespecifieke veranderingen laten zien gedurende de vroege en late stadia van AD. Over het geheel genomen vertegenwoordigen deze bevindingen een veelbelovende stap in de richting van de ontwikkeling van diverse, betrouwbare, webgeoriënteerde biomarkerhulpmiddelen voor AD-onderzoek en klinische toepassingen.
Onze resultaten demonstreren de sterk geconserveerde organisatie van het AD-hersennetwerkproteoom en ondersteunen het gebruik ervan als anker voor systeemgebaseerde biomarkerontwikkeling. Onze analyse laat zien dat twee onafhankelijke TMT-MS-datasets met AD- en AsymAD-hersenen een sterke modulariteit hebben. Deze bevindingen breiden ons eerdere werk uit en demonstreren het behoud van de krachtige modules van meer dan 2.000 hersenweefsels uit meerdere onafhankelijke cohorten in de frontale, pariëtale en temporale cortex (17). Dit consensusnetwerk weerspiegelt verschillende ziektegerelateerde veranderingen die in huidig onderzoek zijn waargenomen, waaronder de toename van gliale-rijke ontstekingsmodules en de afname van neuronrijke modules. Net als huidig onderzoek kent dit grootschalige netwerk ook significante modulaire veranderingen in AsymAD, waaruit een verscheidenheid aan verschillende preklinische pathofysiologie blijkt (17).
Binnen dit zeer conservatieve, op systemen gebaseerde raamwerk bestaat er echter een meer fijnmazige biologische heterogeniteit, vooral onder individuen in de vroege stadia van de ziekte van Alzheimer. Ons biomarkerpanel kan twee subgroepen in AsymAD weergeven, die de significante differentiële expressie van meerdere CSF-markers aantonen. Onze groep was in staat de biologische verschillen tussen deze twee subgroepen te benadrukken, die niet duidelijk waren op het niveau van de belangrijkste AD-biomarkers. Vergeleken met de controlegroep waren de Aβ1-42/totaal tau-verhoudingen van deze AsymAD-individuen abnormaal laag. Alleen de totale tau-niveaus waren echter significant verschillend tussen de twee AsymAD-subgroepen, terwijl de Aβ1-42- en p-tau-niveaus relatief vergelijkbaar bleven. Omdat een hoog CSF-tau een betere voorspeller van cognitieve symptomen lijkt te zijn dan Aβ1-42-niveaus (7), vermoeden we dat de twee AsymAD-cohorten verschillende risico's op ziekteprogressie kunnen hebben. Gezien de beperkte steekproefomvang van onze AsymAD en het gebrek aan longitudinale gegevens is verder onderzoek nodig om deze conclusies met zekerheid te kunnen trekken. Deze resultaten geven echter aan dat een systeemgebaseerd CSF-panel ons vermogen kan vergroten om individuen effectief te stratificeren tijdens het asymptomatische stadium van de ziekte.
Over het geheel genomen ondersteunen onze bevindingen de rol van meerdere biologische functies in de pathogenese van AD. Het ontregelde energiemetabolisme werd echter het prominente thema van al onze vijf gevalideerde etiketteringspanels. Metabolische eiwitten, zoals hypoxanthine-guaninefosforibosyltransferase 1 (HPRT1) en lactaatdehydrogenase A (LDHA), zijn de meest robuust gevalideerde synaptische biomarkers, wat aangeeft dat de toename in AD CSF zeer reproduceerbare seks is. Onze bloedvaten en gliale panelen bevatten ook verschillende markers die betrokken zijn bij het metabolisme van oxidatieve stoffen. Deze bevindingen komen overeen met de sleutelrol die metabolische processen in de gehele hersenen spelen, niet alleen om te voldoen aan de hoge energiebehoefte van neuronen, maar ook om te voldoen aan de hoge energiebehoefte van astrocyten en andere gliacellen (17, 48). Onze resultaten ondersteunen groeiend bewijs dat veranderingen in het redoxpotentieel en onderbreking van energiebanen de belangrijkste link kunnen zijn tussen verschillende sleutelprocessen die betrokken zijn bij de pathogenese van AD, waaronder mitochondriale stoornissen, gliale gemedieerde ontstekingen en vaatschade (49). Bovendien bevatten de biomarkers van het metabolische hersenvocht een groot aantal differentieel rijke eiwitten tussen onze controle- en AD-achtige AsymAD-subgroepen, wat suggereert dat de verstoring van deze energie- en redoxroutes van cruciaal belang kan zijn in het preklinische stadium van de ziekte.
De verschillende hersen- en hersenvochtpaneltrends die we hebben waargenomen, hebben ook interessante biologische implicaties. Synapsen en metabolieten die rijk zijn aan neuronen vertonen verminderde niveaus in de AD-hersenen en een verhoogde overvloed aan hersenvocht. Gegeven dat neuronen rijk zijn aan energieproducerende mitochondria bij synapsen om energie te leveren voor hun talrijke gespecialiseerde signalen (50), wordt de gelijkenis van de expressieprofielen van deze twee neurongroepen verwacht. Het verlies van neuronen en de extrusie van beschadigde cellen kunnen deze hersen- en CSV-paneltrends bij latere ziekten verklaren, maar ze kunnen de vroege panelveranderingen die we waarnemen niet verklaren (13). Een mogelijke verklaring voor deze bevindingen bij vroege asymptomatische ziekten is abnormaal synaptisch snoeien. Nieuw bewijs in muismodellen suggereert dat microglia-gemedieerde synaptische fagocytose abnormaal kan worden geactiveerd bij AD en kan leiden tot vroeg synapsverlies in de hersenen (51). Dit weggegooide synaptische materiaal kan zich ophopen in het hersenvocht. Daarom zien we de toename van het hersenvocht in het neuronenpaneel. Immuungemedieerd synaptisch snoeien kan ook gedeeltelijk de toename van gliale eiwitten verklaren die we tijdens het ziekteproces in de hersenen en het hersenvocht waarnemen. Naast synaptisch snoeien kunnen algemene afwijkingen in de exocytische route ook leiden tot verschillende hersen- en hersenvochtexpressies van neuronale markers. Een aantal onderzoeken hebben aangetoond dat de inhoud van exosomen in de pathogenese van AD-hersenen is veranderd (52). De extracellulaire route is ook betrokken bij de proliferatie van Aβ (53, 54). Het is vermeldenswaard dat onderdrukking van exosomale secretie AD-achtige pathologie in AD-transgene muismodellen kan verminderen (55).
Tegelijkertijd vertoonde het eiwit in het vasculaire panel een gematigde toename in de AD-hersenen, maar significant afgenomen in de CSF. De disfunctie van de bloed-hersenbarrière (BBB) kan deze bevindingen gedeeltelijk verklaren. Veel onafhankelijke postmortemstudies bij mensen hebben een afbraak van de BBB bij AD aangetoond (56, 57). Deze onderzoeken bevestigden verschillende abnormale activiteiten rond deze goed afgesloten laag endotheelcellen, waaronder lekkage van hersencapillairen en perivasculaire accumulatie van door bloed overgedragen eiwitten (57). Dit kan een eenvoudige verklaring bieden voor de verhoogde vasculaire eiwitten in de hersenen, maar het kan de uitputting van deze zelfde eiwitten in het hersenvocht niet volledig verklaren. Eén mogelijkheid is dat het centrale zenuwstelsel deze moleculen actief isoleert om het probleem van verhoogde ontstekingen en oxidatieve stress op te lossen. De vermindering van enkele van de meest ernstige CSF-eiwitten in dit panel, vooral die betrokken zijn bij de regulering van lipoproteïnen, houdt verband met de remming van schadelijke ontstekingsniveaus en het neuroprotectieve proces van reactieve zuurstofsoorten. Dit geldt voor Paroxonase 1 (PON1), een lipoproteïnebindend enzym dat verantwoordelijk is voor het verminderen van oxidatieve stressniveaus in de bloedsomloop (58, 59). Alfa-1-microglobuline/bikunine-precursor (AMBP) is een andere significant neerwaarts gereguleerde marker van de vasculaire groep. Het is de voorloper van de lipidetransporter bikunine, die ook betrokken is bij ontstekingsonderdrukking en neurologische bescherming (60, 61).
Ondanks verschillende interessante hypothesen is het onvermogen om biochemische ziektemechanismen direct te detecteren een bekende beperking van ontdekkingsgestuurde proteomics-analyse. Daarom is verder onderzoek nodig om met vertrouwen de mechanismen achter deze biomarkerpanels te definiëren. Om vooruitgang te boeken in de richting van de ontwikkeling van op MS gebaseerde klinische analyses vereist de toekomstige richting ook het gebruik van gerichte kwantitatieve methoden voor grootschalige biomarkerverificatie, zoals selectieve of parallelle reactiemonitoring (62). We hebben onlangs parallelle reactiemonitoring (63) gebruikt om veel van de hier beschreven CSF-eiwitveranderingen te valideren. Verschillende prioriteitspaneldoelen worden met aanzienlijke nauwkeurigheid gekwantificeerd, waaronder YWHAZ, ALDOA en SMOC1, die respectievelijk in verband staan met onze synaps-, metabolisme- en ontstekingspanels (63). Onafhankelijke gegevensverzameling (DIA) en andere op MS gebaseerde strategieën kunnen ook nuttig zijn voor doelverificatie. Bud et al. (64) Onlangs werd aangetoond dat er een significante overlap bestaat tussen de AD-biomarkers die zijn geïdentificeerd in onze CSF-ontdekkingsdataset en de onafhankelijke DIA-MS-dataset, die bestaat uit bijna 200 CSF-monsters uit drie verschillende Europese cohorten. Deze recente onderzoeken ondersteunen het potentieel van onze panelen om te transformeren in betrouwbare MS-gebaseerde detectie. Traditionele antilichaam- en aptameergebaseerde detectie is ook belangrijk voor de verdere ontwikkeling van belangrijke AD-biomarkers. Vanwege de lage overvloed aan CSF is het moeilijker om deze biomarkers te detecteren met behulp van MS-methoden met hoge doorvoer. NEFL en NRGN zijn twee van zulke voorbeelden van CSF-biomarkers met een lage overvloed, die in onze uitgebreide analyse aan het panel zijn toegewezen, maar die niet op betrouwbare wijze kunnen worden gedetecteerd met behulp van onze enkele MS-strategie. Targetingstrategieën gebaseerd op meerdere antilichamen, zoals PEA, kunnen de klinische transformatie van deze markers bevorderen.
Over het geheel genomen biedt deze studie een unieke proteomics-aanpak voor de identificatie en verificatie van CSF AD-biomarkers op basis van verschillende systemen. Het optimaliseren van deze markerpanels over aanvullende AD-cohorten en MS-platforms kan veelbelovend blijken om de AD-risicostratificatie en -behandeling te bevorderen. Studies die het longitudinale niveau van deze panels in de loop van de tijd evalueren, zijn ook van cruciaal belang om te bepalen welke combinatie van markers het risico op vroege ziekte en veranderingen in de ernst van de ziekte het beste stratificeert.
Met uitzondering van de drie door CSF gekopieerde monsters, werden alle CSF-monsters die in dit onderzoek werden gebruikt, verzameld onder auspiciën van Emory ADRC of nauw verwante onderzoeksinstellingen. In deze proteomics-onderzoeken werden in totaal vier sets Emory CSF-monsters gebruikt. Het CSV-cohort bleek monsters te bevatten van 20 gezonde controles en 20 AD-patiënten. CSF-kopie 1 bevat monsters van 32 gezonde controles, 31 AsymAD-individuen en 33 AD-individuen. CSF-kopie 2 bevat 147 controles en 150 AD-monsters. Het 4-cohort van CSF-replicatie met meerdere ziekten omvatte 18 controles, 17 AD-, 19 ALS-, 13 PD- en 11 FTD-monsters. Volgens de overeenkomst die is goedgekeurd door de Emory University Institutional Review Board, hebben alle deelnemers aan de Emory-studie geïnformeerde toestemming verkregen. Volgens de National Institute of Aging Best Practice Guidelines for Alzheimer's Centers uit 2014 (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html) werd hersenvocht opgevangen en opgeslagen door middel van een lumbale punctie. Controle- en AsymAD- en AD-patiënten ontvingen gestandaardiseerde cognitieve beoordeling bij Emory Cognitive Neurology Clinic of Goizueta ADRC. Hun hersenvochtmonsters werden getest door INNO-BIA AlzBio3 Luminex voor ELISA Aβ1-42, totale tau- en p-tau-analyse (65). ELISA-waarden worden gebruikt ter ondersteuning van de diagnostische classificatie van proefpersonen op basis van vastgestelde AD-biomarker-cut-off-criteria (66, 67). Demografische en diagnostische basisgegevens voor andere CSV-diagnoses (FTD, ALS en PD) worden ook verkregen van Emory ADRC of aangesloten onderzoeksinstellingen. De samenvattende metadata van de casus voor deze Emory CSF-casussen zijn te vinden in Tabel S1A. De kenmerken van het Zwitserse CSF-replicatie 3-cohort zijn eerder gepubliceerd (45).
CSF heeft het monster gevonden. Om de diepgang van onze ontdekking van de CSF-dataset te vergroten, werd vóór trypsinisatie de immuunconsumptie van eiwitten met een grote hoeveelheid eiwitten uitgevoerd. Kortom, 130 μl CSF uit 40 individuele CSF-monsters en een gelijk volume (130 μl) High Select Top14 Abundance Protein Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) werden in een spinkolom (Thermo Fisher Scientific, A89868) in de kamer geplaatst. temperatuur Incuberen). Na 15 minuten centrifugeren wordt het monster gedurende 2 minuten bij 1000 g gecentrifugeerd. Een 3K ultracentrifugaal filterapparaat (Millipore, UFC500396) werd gebruikt om het effluentmonster te concentreren door 30 minuten bij 14.000 g te centrifugeren. Verdun alle monstervolumes tot 75 μl met fosfaatgebufferde zoutoplossing. De eiwitconcentratie werd geëvalueerd met de bicinchoninezuur (BCA)-methode volgens het protocol van de fabrikant (Thermo Fisher Scientific). Het immuno-uitgeputte CSF (60 μl) van alle 40 monsters werd gedigereerd met lysyl-endopeptidase (LysC) en trypsine. Kortom, het monster werd bij 90°C gedurende 10 minuten gereduceerd en gealkyleerd met 1,2 µl 0,5 M tris-2(-carboxyethyl)-fosfine en 3 µl 0,8 M chlooraceetamide, en vervolgens gedurende 15 minuten in een waterbad gesoniceerd. Het monster werd verdund met 193 μl 8 M ureumbuffer [8 M ureum en 100 mM NaHPO4 (pH 8,5)] tot een eindconcentratie van 6 M ureum. LysC (4,5 μg; Wako) wordt gebruikt voor vertering gedurende de nacht bij kamertemperatuur. Het monster werd vervolgens verdund tot 1 M ureum met 50 mM ammoniumbicarbonaat (ABC) (68). Voeg een gelijke hoeveelheid (4,5 μg) trypsine (Promega) toe en incubeer het monster vervolgens gedurende 12 uur. Zuur de verteerde peptideoplossing aan tot een eindconcentratie van 1% mierenzuur (FA) en 0,1% trifluorazijnzuur (TFA) (66), en ontzout vervolgens met een Sep-Pak C18-kolom van 50 mg (Waters) zoals hierboven beschreven (25). . Het peptide werd vervolgens geëlueerd in 1 ml 50% acetonitril (ACN). Om de eiwitkwantificering over batches te standaardiseren (25), werden aliquots van 100 μl van alle 40 CSF-monsters gecombineerd om een gemengd monster te genereren, dat vervolgens werd verdeeld in vijf monsters van de Global Internal Standard (GIS) (48). Alle individuele monsters en gecombineerde standaarden worden gedroogd door middel van hogesnelheidsvacuüm (Labconco).
CSF kopieert het monster. Dayon en collega's hebben eerder de uitputting van het immuunsysteem en de vertering van CSF-kopie 3-monsters beschreven (45, 46). De resterende replicaatmonsters waren niet individueel immunologisch uitgeput. Verteer deze niet-verwijderde monsters in trypsine zoals eerder beschreven (17). Voor elke herhaalde analyse werden aliquots van 120 μl van het geëlueerde peptide uit elk monster samengevoegd en verdeeld in gelijke volumes om te gebruiken als de TMT-gelabelde mondiale interne standaard (48). Alle individuele monsters en gecombineerde standaarden worden gedroogd door middel van hogesnelheidsvacuüm (Labconco). Om het signaal van het weinig voorkomende CSF-eiwit te versterken, door 125 μl van elk monster te combineren, werd voor elke replicaatanalyse een “verbeterd” monster bereid [dat wil zeggen, een biologisch monster dat het onderzoeksmonster nabootst, maar de beschikbare hoeveelheid is veel groter (37, 69)] samengevoegd in een gemengd CSV-monster (17). Het gemengde monster werd vervolgens immunologisch verwijderd met behulp van 12 ml High Select Top14 Abundance Protein Removal Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372), gedigereerd zoals hierboven beschreven, en opgenomen in de daaropvolgende meervoudige TMT-labeling.
Posttijd: 27 augustus 2021